利用黄鳝性逆转模型探索piRNA通路在性别决定中的作用机制

The Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway is a small RNA silencing system, which functions in gametogenesis, transposon silencing and genome integrity across the animal phylogeny. Recent study revealed that female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm. However, the relationship of vertebrate piRNA pathway and sex determination is not clear yet. The swamp eel (Monopterus albus), which can transform its sex from female via intersex into male, is a model species for studying sex determination. Our preliminary data showed piRNAs were differently expressed in three kinds of gonads (ovary, ovotestis, and testis) of the swamp eel. Notably we found that five piRNA pathway genes in the swamp eel evolved more rapidly than that in other vertebrate species significantly, indicating a neofunctionalization of the swamp eel piRNA pathway and a possible role in the process of sex reversal. Combining techniques and approaches from a range of disciplines including evolution analysis, molecular cell biology and bioinformatics, this project focus on the functions of piRNA pathway in the sex reversal of the swamp eel based on molecular, cellular and individual levels. We believe the completion of this project will greatly help people to understand the relationship of vertebrate piRNA pathway and sex determination, which will also benefit our understanding of the mechanisms in fish germline specification and sex determination.

piRNA通路是近年来在多种模式动物性腺中发现的小RNA通路，在配子生成、转座子抑制及维护基因组的完整性等方面发挥着重要的作用。最近研究发现piRNA是家蚕的重要性别决定因子。目前脊椎动物piRNA通路与性别决定的关系还不清楚。黄鳝具有天然性逆转的特性，是研究性腺分化及性别决定的模式物种。我们在预实验中发现雌性、兼性、雄性黄鳝的性腺中存在不同类型的piRNAs，进化分析发现黄鳝的5个piRNA通路基因加速进化，提示黄鳝的piRNA通路可能发生了基因的新功能化，可能在黄鳝的性逆转中发挥作用。本项目拟结合进化分析、分子细胞学实验及生物信息学分析，从分子、细胞、个体等多个层次对黄鳝性逆转过程中piRNA通路的功能展开系统而深入的研究。本项目将有助于阐明脊椎动物piRNA通路与性别决定的关系，对于揭示鱼类性腺分化及性别决定机制也具有重要意义。

piRNA通路是一类在动物生殖细胞中发挥重要生物学功能的小RNA通路，在多种模式动物的性腺中，均检测到了大量的piRNA分子。黄鳝(Monopterus albus)是具有天然性逆转特征的硬骨鱼，是研究性别发育机制的模式生物。本项目以黄鳝作为研究模型，围绕piRNA通路在黄鳝性逆转过程的作用为中心开展研究。. 我们鉴定了黄鳝piRNA通路的核心基因，通过系统发育分析明确了这些基因之间的进化关系。通过表达谱分析，我们发现Ago家族基因在黄鳝组织中广谱表达，piRNA通路基因则主要在性腺中表达，在黄鳝三种性腺中，piRNA 通路基因的表达远高于Ago基因的表达。通过制备黄鳝Piwil1（eiwi）和Piwil2（eili）的多克隆抗体，我们检测了eiwi和eili蛋白在体内的表达，探明了它们内源表达规律。黄鳝piRNA通路基因在性逆转过程表达量递增，说明其在性逆转中具有重要的功能，这些研究为将来进一步阐明黄鳝性腺分化机制提供了理论基础。. 细胞定位分析发现Ago家族基因和Piwi家族基因主要在细胞质表达。通过在细胞系中共转Piwi基因和Tdrd2（Tdrkh），免疫共沉淀及WB检测，发现Piwil1与Tdrd2有很强的相互作用，而Piwil2与Tdrd2的相互作用比较弱。本研究首次发现鱼类Piwi蛋白和Tdrd2蛋白的相互作用，为将来研究TDRD家族基因的功能奠定了基础。我们通过进化分析，发现piRNA通路基因比miRNA/siRNA通路基因进化更快。对TDRD家族基因的选择压力分析及适应性进化的研究，进一步探明了这个家族的进化规律。对mili基因启动子区CpG岛的甲基化模式分析，发现该启动子的甲基化水平与基因表达呈负相关，mili 启动子分析有利于我们进一步认识黄鳝 eili 基因的转录调控规律。 . 本项目利用黄鳝性逆转模型探索piRNA通路在性别决定中的作用机制，对于丰富人们对于这类非编码小RNA的认知，揭示动物进化过程保留下来的性别决定分子机制有着重要意义，对于我们深入认识鱼类性腺发育机制也具有重要意义。