Wnt/PCP信号通路在胚胎干细胞定向分化构建再生晶状体的作用及机制的研究

Cataract extraction with implanted intraocular lens (IOL) is the only effective way for cataract treatment. However, some intrinsic defects of IOL is unacceptable for cataract patients. Here we propose a question that whether it is feasible to regenerate a new biologic lens with some regeneration biological techniques. In our previous studies, we had found that cell sources and cell alignment were two key factors in constructing rabbit regenerated lens in vivo. Embryonic stem cell now has been considered as a good tool for lens regeneration for its self-renew and pluripotent ability. On the other hand, it has been well established that Wnt/PCP signal pathway plays an important role in regulating cellular morphology and alignment. Therefore, the aim of this project is to illustrate the role and mechanism of Wnt/PCP signal pathway in mouse ES cell-induced lens regeneration. Besides, we plan to screen some functional Wnt/PCP targeted genes and proteins with High-throughput sequencing and 2D electrophoresis, to conclude a most suitable proposal for lens regeneration and thereafter provide a wider field for cataract treatment studies.

白内障摘除联合人工晶状体植入是目前治疗白内障的唯一手段，而人工晶状体固有的缺陷难以满足患者的视觉要求。由此提出设想：能否利用再生生物学技术，构建具有完整生物学功能的晶状体替代人工晶状体？课题组前期已在兔眼建立初级晶状体再生模型，发现种子细胞的来源和细胞排列紊乱是影响再生晶状体功能和透明性的主要因素。胚胎干细胞（ES细胞）具有自我更新和多向分化的潜能，为晶状体再生提供了理想的工具。Wnt/PCP信号通路是近年发现的能够调控晶状体细胞形态、排列的重要通路。因此，本项目拟利用ES细胞诱导再生晶状体，通过干预Wnt/PCP通路，探索构建具有生理结构和功能的再生晶状体的最佳方案，并且借助高通量测序、双向电泳等技术，研究Wnt/PCP在再生晶状体中的分子机制，为白内障治疗开辟新的领域。

人工晶状体固有的缺陷难以满足白内障患者的视觉要求，由此我们提出设想：能否利用再生生物学技术，构建具有完整生物学功能的晶状体替代人工晶状体？在本项目中，课题组利用人胚胎干细胞（hES细胞）体外诱导再生晶状体的模型，借助高通量测序等技术，探索晶状体体外再生过程中转录因子的动态变化；进一步通过干预Wnt/PCP通路，研究Wnt/PCP通路在晶状体再生中作用及分子机制。. 本项目的研究目标包括以下三部分：(1)诱导hES细胞定向分化为晶状体小体，体外构建具有生理结构和功能的再生晶状体模型; (2)探索晶状体再生过程的转录因子变化及关键通路；(3) 明确Wnt/PCP信号通路对晶状体细胞再生的作用及机制。. 课题组已按计划完成上述目标。首先，通过“三步法”成功将hES细胞诱导为透明透镜状的晶状体小体，并检测了晶状体特异性基因和蛋白的表达情况。接着，借助高通量测序，根据关键转录因子的变化揭示了晶状体再生的3个阶段对应晶状体体内早期发育的的关键阶段，分别是前基板外胚层、晶状体基板和晶状体泡时期，同时验证了该体外再生模型可模拟体内晶状体的发育过程。最后，我们在诱导后期外源性加入Wnt5a以激活Wnt/PCP通路，发现获得的晶状体小体数量增多、面积增大，晶状体特异性蛋白表达明显升高，提示Wnt5a可促进再生晶状体的分化。此外，我们检测到Wnt/PCP通路下游DVL2、RAC1和JNK通路的活性显著升高，因此我们推测Wnt5a可以通过非经典Wnt通路促进体外再生晶状体的形成。为了验证这项推测，我们使用RNA干扰技术，敲降hES细胞中的Wnt5a，结果发现，Wnt5a敲降后诱导获得的晶状体小体数量减少且面积减小，相应的晶状体特异性蛋白的表达也随之减少，同时Wnt/PCP通路下游的DVL2、RAC1和JNK活性也明显降低。. 本项目的意义和创新之处在于，通过高通量测序技术，明确体外构建再生晶状体过程中转录因子和通路的动态变化；另外，我们首次通过体外诱导模型，探索Wnt/PCP通路对再生晶状体形成的具体分子机制。这为体外构建生物学结构更加完善的再生晶状体提供理论依据，为完善原位再生晶状体提供新思路。