Prohibitin在缺氧性肾小管上皮细胞损伤中的作用及分子机制研究

肾小管上皮细胞（RTEC）损伤是肾小管间质纤维化的重要原因。损伤的RTEC发生表型转化、释放致纤维化因子，在此过程中氧自由基起重要作用。研究发现Prohibitin（PHB）具有抗氧化、抗增殖等作用，故可能作为治疗肾小管间质纤维化新的靶点。我们前期的研究显示，PHB在肾小管间质纤维化大鼠的RTEC中表达显著下调，且与肾小管间质纤维化的严重程度呈负相关。但PHB在RTEC损伤中的作用及机制目前尚未见报道。本项目首次探讨PHB在RTEC损伤中的作用及分子机制，内容包括：（1）构建缺氧性RTEC损伤模型，研究PHB1和PHB2在RTEC中的亚细胞定位。（2）siRNA PHB1和PHB2以及转染外源性PHB1和PHB2，研究PHB对RTEC损伤的影响。（3）检测氧自由基、线粒体膜电位、细胞色素C等变化，探讨PHB影响RTEC损伤可能的信号通路及机制。本研究将为临床防治肾小管间质纤维化提供新思路。

本课题基本完成计划书要求的实验内容。通过构建pLP1- PHB1+、pLP1- PHB2+、pLP1- PHB1-、pLP1- PHB2-、阴性对照pLP1-eGFP病毒载体。因基因干扰实验需要而设立7个实验组：正常组、缺氧处理组（模型组）、PHB1+组、PHB2+组、PHB1-组、PHB2-组、阴性对照组。PHB1+组、PHB2+组、PHB1-组、PHB2-组、阴性对照组RTEC于添加基因干扰试剂48h与后行缺氧处理。缺氧处理的方法如下：将RTEC细胞置于真空干燥罐中，采用负压吸引器抽吸真空罐中残余气体，继而充以体积分数为95%N2和5%CO2的缺氧混合气体，密封的方法诱导缺氧性损伤；缺氧处理48小时收获各组细胞行相关检测。模型组RTEC只做缺氧处理48小时；而正常组RTEC不做任何处理。应用RT-PCR方法检测各组RTEC中PHB1、PHB2和TGF-β1的mRNA表达；应用Western-blot方法检测RTEC细胞PHB1、PHB2、TGF-β1、Col-IV和FN的蛋白表达；流式细胞仪检测RTEC凋亡情况和线粒体膜电位ΔΨm的变化；通过试剂盒测定ROS、MDA、SOD和GSH的含量；扫描电镜和透射电镜分别检测细胞形态变化和线粒体形态变化。我们研究发现：在体外培养的缺氧性RTEC损伤中，PHB1和PHB2表达显著降低参与了氧化损伤过程。上调PHB1和PHB2的表达具有抗氧化损伤的作用，其分子机制可能与PHB1和PHB2减少ROS、MDA等的产生，下调TGF-β1和ECM表达有关。本研究发表了中文核心期刊论文3篇，SCI6篇。培养博士研究生毕业1名，硕士研究生毕业3名。