肽类药物肠道内可控表达与给药新技术及药理机制研究

It will be a new approach with advantages of economic, high efficiency and convenience for diseases reatment if the gut is used as biological reactor for drug production and transformation. A expressing vector of bifidobacterium is constructed with the promotor and secretory signal peptide of polysaccharide glycosidase in this project. The target peptides expression is induced in transformed bifidobacteria in intestinal tract. The glucagon-like peptide-1(7-36) amide (GLP-1) delived peptide GLP-1G8 and the reporter gene Renilla luciferase (Rluc) will be used as the representative peptides to learn the mechanism of peptide drug acting in intestinal tract. The animal in vivo optical imaging, isotope labelling, liquid chromatography-mass spectrometry, enzymic chemistry and immunological assay are used to detect the expression, absorption, distribution, metabolism and excretion of peptide drugs.The biological functions and mechanism in insulin stimulating and blood glucose decrease of GLP-1G8 are verified by diabete type 2 mouse model treatment with GLP-1G8 transformed bifidobacteria. The main innovation of this project is to regulate the expression of target peptide using intestinal tract as a reactor and oligosaccharide as the inducer.

把胃肠道作为一个药物生成与转化的生物反应器，具有经济、高效、便利的优点，将为疾病预防和治疗提供一条新途径。项目通过构建双歧杆菌表达载体，以聚糖酶启动子和分泌信号肽控制目的基因的表达，在肠道内诱导调控多肽药物表达，建立一种新型的肽类药物表达和给药系统。以胰升血糖素样肽－1变构肽GLP-1G）和报告基因海肾荧光素酶(Rluc)作为代表性多肽，采用活体动物体内光学成像技术、同位素标记、液相色谱-质谱、酶化学和免疫测定技术分析多肽在肠道内的表达、代谢和吸收等规律，体内外治疗2型糖尿病小鼠模型实验验证GLP-1G8刺激胰岛素分泌、降血糖等生物学作用，探讨药理学作用机制，为肽类药物肠道可控表达系统的推广应用提供技术参考。项目利用肠道为生物反应器，以低聚糖为诱导剂在肠道内调控目的多肽的表达。在肽类药物表达生产和给药方式方面有突出的理论和技术创新。

本项目基本按照预定的研究计划开展研究，并全部完成预定的研究目标。项目的主要研究内容是构建乳酸菌肠道内可控表达载体，筛选并获得了报告基因GFP、Rluc和肠肽激素GLP-1类似肽GLP、EX4基因转化双歧杆菌和乳酸菌。通过体外诱导表达实验，以及转化菌活菌口服途径肠道内诱导表达实验，证实目的基因能够以低聚糖为诱导剂，在肠道内分泌表达；确认肠道内乳酸菌表达的多肽保留生物学活性；荧光标记肠肽激素肠道内“U形管”实验证实，部分肠肽激素可通过受体介导的内吞作用跨越肠粘膜屏障进入血液循环发挥全身作用；2型糖尿病模型小鼠体内治疗实验显示，GLP和EX4基因转化乳酸菌活菌口服途径可以降低糖尿病小鼠血糖，恢复胰岛功能。项目的重要结果是构建了肠道内可控表达系统，证明了乳酸菌肠道内表达的功能多肽可通过受体介导的内吞作用穿过肠粘膜屏障发挥作用。这些实验数据将为以重组益生菌为宿主菌，以胃肠道作为生物反应器的新型生物治疗技术的进一步开发和应用提供实验依据，有助于提高疾病的防治水平。