雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶多拷贝基因上游调控序列的克隆及其调控功能的分析

雨生红球藻是虾青素含量最高的生物之一，最新的研究证明雨生红球藻虾青素含量与β-胡萝卜素酮化酶基因（bkt）关系密切，胁迫后bkt的转录活性可提高至少40倍，这可能是bkt的多拷贝特性和上游调控序列对胁迫因子的高响应度在转录水平调控bkt转录活性，但具体的调控机制还不清楚。因此，本研究首次提出利用莱茵衣藻转化技术成熟、研究背景清晰的优点构建莱茵衣藻外源调控序列检测体系。通过5′端缺失突变、3′端缺失突变和内部缺失突变实验系统地研究bkt上游调控序列在强光、高盐和低盐等胁迫条件下的启动子活性，从而确认它的核心启动子序列和具有重要调控功能的顺式作用元件。然后，通过顺式作用元件叠加、缺失和串联实验验证其调控功能。该研究将建立莱茵衣藻外源基因调控序列检测体系，阐明bkt在转录水平的调控机理，有助于深入研究虾青素合成酶基因的调控机理，实现对虾青素合成代谢的精细调控，为藻逆境生物学研究提供新思路和方法。

雨生红球藻虾青素的合成调控发生在转录水平，β-胡萝卜素酮化酶是雨生红球藻中虾青素合成的关键酶之一，然而它的转录调控机理还不清楚。为此，本研究围绕bkt启动子的功能进行研究，获得的结果主要有：（1）本研究构建了雨生红球藻34-1n的基因组文库，由文库中获得3584bp的bkt1 和3737bp 的bkt2上游调控序列，它们除含有一个TATA-box（-299bp）和多个CAAT-box等启动子所必需的调控元件外，还含有多个与光照和环境胁迫相关的调控元件。Bkt1和bkt2上游调控序列能在莱茵衣藻CC-849表达ble, PCR和Southern杂交结果都显示ble已整合进转基因藻的核基因组，荧光定量PCR结果显示bkt1和bkt2启动子均可响应强光和醋酸钠胁迫，提高转录活性，并提高BLE的表达量，最终增强转基因藻的Zeomycin抗性。（2）本研究利用莱茵衣藻CC-849建立一个可用于研究雨生红球藻bkt上游调控序列功能的体系和方法，以pSP124质粒为基础构建了莱茵衣藻启动子功能检测T载体。研究结果显示：转化子中均含有ble基因，并成功表达了BLE蛋白。实验初步证明bkt1启动子的450bp序列具有启动子活性，可能是它的核心序列，含有与醋酸钠胁迫相关的调控元件；1986bp序列上有较多响应醋酸钠胁迫的正调控元件，但也可能含有抑制外源基因在莱茵衣藻中整合的负调控序列；它的200bp序列则由于失去了TATA-box等必需序列而失去启动子活性。荧光定量PCR结果表明bkt2-RBCS2融合启动子从转录水平上调控ble，不同的光照强度和醋酸钠浓度对ble的转录活性有影响，进而影响到BLE蛋白的表达量，0.5kb的bkt2启动子片段则可能因为调控元件数目太少而没有功能。（3）在强光照和醋酸钠胁迫下，雨生红球藻总抗氧化能力变化经历两个阶段。醋酸钠胁迫12h快速提高SOD的酶活性，胁迫处理12h后雨生红球藻可检测到虾青素，48h接近最大值，此时的提取物具备很强的超氧阴离子和羟自由基清除能力。（4）初步认为雨生红球藻脂肪酸合成酶BC基因、ACP基因、KAS基因和FATA基因在脂肪酸合成过程中发挥重要作用，可能是绿藻脂肪酸合成途径中的重要限速基因。本研究首次获得bkt启动子并对其功能进行了研究，为研究雨生红球藻虾青素合成调控的分子机理提供了可靠的实验数据、创新的研究思路与方法。