吴茱萸碱通过阻断STAT-3信号通路对肿瘤细胞侵袭转移的抑制作用及其机制

Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT-3) was persistent activated in most tumor cells. STAT-3 was the valve of genes related with tumor development, proliferation, metastasis, invasion and angiogenesis. Applicant established anti-tumor screening platform for the traditional Chinese medicine based on the luciferase reporter gene assay. Using this screening system we found that evodiamine, a traditional Chinese medicine monomer, could inhibit constitutive- and induced-STAT-3 phosphorylation levels and the downstream tumor invasion and metastasis related gene expression. In order to investigate the mechanism of evodiamine induced blockage of STAT-3 signal pathway, Western blot, EMSA, reporter gene assay and RNAi assay were used in this project. Consider the different growth inhibitory activity on tumor cells and normal cells, nude mice model was used to evaluate the in vivo efficacy and safety of evodiamine. The results could be guidance for the clinical application of Chinese herbal medicine.

信号转导和转录激活因子（STAT-3）在大多数肿瘤细胞内持续性激活，是起闭肿瘤发生、发展、转移、扩散、血管生成等恶性行为相关基因的"总阀门"。申请者系统建立了以荧光素酶报告基因检测为核心技术的抗肿瘤中药活性成分筛选平台，首次发现中药单体吴茱萸碱可抑制肝癌细胞HepG2组成型和诱导型STAT-3磷酸化水平；并可抑制STAT-3下游多种肿瘤转移侵袭关键因子的表达。为进一步研究吴茱萸碱调控STAT-3通路的作用机理，本课题拟应用Western blot、EMSA、报告基因检测、RNAi、信号通路阻断等技术研究吴茱萸碱调节STAT-3信号通路的蛋白靶点，并结合其对肿瘤细胞和正常细胞生长的不同抑制活性，利用裸鼠荷瘤实验评价其成为抗肿瘤药物的体内药效和安全性，以指导吴茱萸碱的产品开发和中草药的临床应用。

JAK2/STAT信号通路的激活促进了肿瘤细胞异常增殖、侵袭转移、血管生成并增强了肿瘤细胞的免疫逃避功能，在肿瘤的发生、发展及演进中发挥了举足轻重的作用。在多种肿瘤细胞中都发现了STAT3的持续激活，以JAK2/STAT3信号通路作为肿瘤分子治疗的靶点，筛选出能阻断肿瘤细胞中STAT3信号通路的药物对于预防和治疗肿瘤具有积极意义。吴茱萸碱是传统中药吴茱萸中的主要生物碱之一，具有抗炎、免疫调节等作用，此外很多研究表明吴茱萸碱还具有抗肿瘤活性。本项目研究结果表明吴茱萸碱可抑制HepG2细胞增殖，将细胞周期阻滞于G2/M期，并诱导肝癌细胞凋亡，阻止其侵袭转移。在原代培养的人脐静脉内皮细胞上发现吴茱萸碱可抑制小管的形成。进一步机制研究发现吴茱萸碱抑制了肝癌HepG2细胞中组成型及IL-6诱导型的STAT3的磷酸化，同时抑制了STAT3上游激酶JAK2、ERK1/2及Src 的组成型激活，阻断了STAT3信号传导通路。酪氨酸磷酸酶抑制剂过钒酸钠逆转了吴茱萸碱对IL-6诱导的STAT3磷酸化的抑制作用，提示酪氨酸磷酸酶参与到了吴茱萸碱抑制STAT3磷酸化的过程中。研究证明吴茱萸碱确实诱导了一种酪氨酸磷酸酶SHP-1的表达，RNA干扰技术抑制SHP-1蛋白的表达后逆转了吴茱萸碱对IL-6诱导的STAT3磷酸化的抑制作用。吴茱萸碱还上调了STAT3信号通路抑制因子SOCS-3的mRNA水平。STAT3的转录活力以及受STAT3调控的下游基因表达蛋白Bcl-2, Mcl-1, cyclin D1, HIF1-α, MMP-9, VEGF和survivin的水平均被吴茱萸碱所抑制。吴茱萸碱对裸鼠HepG2异种移植瘤的体内研究表明，吴茱萸碱抑制了HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤的生长，且吴茱萸碱处理并未降低带瘤裸鼠的生存质量。本项目研究结果提示吴茱萸碱通过诱导酪氨酸磷酸酶SHP-1及STAT3信号通路抑制因子SOCS-3的表达升高，抑制STAT3上游激酶的活化，从而抑制了STAT3的活化，阻断JAK2/STAT3信号转导通路并抑制了STAT3通路下游调控基因的表达，最终诱导了HepG2细胞凋亡，并显示出体内抗肿瘤活性。吴茱萸碱作为一种天然的STAT3信号通路抑制剂具有开发成抗肝癌天然药物的潜力。