肠炎沙门氏菌MMR系统关键基因在抗性演化中的分子机制

Long term abuse of antibiotics lead to the appearance of the antibiotic resistant strains of Salmonella, increasing the risk of animal, human health and environmental pollution. DNA mismatch repair (MMR) system, which strictly inhibits the bacterial DNA recombination and mutation, is closely related with the development of drug resistance and transmission. However, the molecular mechanism of MMR system for the salmonella enteritidis in the process of evolution of antibiotic resistance has not been elucidated to date. The construction of salmonella enteritidis SE26 MMR system key gene (mutS, mutL, mutH and uvrD) deletion strains will be conducted through Red homologous recombination technology. The dynamic bacterial evolution process of antibiotic resistance was analyzed by monitoring SE26 strains and the MMR gene-deleted mutants with Experimental Evolution experiment scheme. To study the impacts of MMR system key genes on  time and order variation of drug target genes of quinolone, beta lactam, aminoglycoside, will contribute to understand the correlation between MMR system and durg targets. To explore the impact of MMR system potential "genetic switch" sequence on new drug resistance, which is going to provide theoretical basis for discovery new mechanism of antibiotic resistance.

长期滥用抗生素导致沙门氏菌耐药菌株不断出现，增加了动物、人类健康和环境污染的风险。DNA错配修复系统（MMR）严格抑制细菌DNA重组和突变，又与其耐药性的产生与传播密切相关，但关于肠炎沙门氏菌MMR系统在抗性演化过程中的分子机制还未见报道。本项目通过Red同源重组技术，构建肠炎沙门氏菌SE26株MMR系统关键基因（mutS、mutL、mutH和uvrD）缺失株，利用Experimental Evolution实验方案，全程动态监测SE26株及其MMR基因缺失株对抗生素产生耐药的演化过程。研究SE26株MMR系统的关键基因在抗性演化过程中对喹诺酮类、β-内酰胺类、氨基糖苷类药物靶标基因的变异时间和顺序的影响，明确该系统与药物靶标基因的变异相关性。探索MMR系统潜在的“遗传开关”序列是否影响细菌产生新的耐药性。本研究对探索细菌耐药机制具有重要科学意义。

沙门氏菌（Salmonella）在全球公共卫生学上，是具有重要意义的人兽共患病原菌之一，也是引起人和动物食物中毒的主要食源性病原菌。长期滥用抗生素导致沙门氏菌耐药菌株不断出现，增加了动物、人类健康和环境污染的风险。本项目通过Red同源重组技术，构建沙门氏菌MMR系统关键基因和TolC缺失株，利用Experimental Evolution实验方案，全程动态监测亲本株及其缺失株对抗生素产生耐药的演化过程。.基于此，本研究首先开展对兰州地区的动物源零售食品样本中的沙门氏菌的喹诺酮类耐药现状及流行特点进行分析，共分离到41株，10种不同的血清型沙门氏菌。随后又在21株耐喹诺酮类药物的沙门氏菌中发现了不同程度的QRDR突变及携带的PMQR基因。明确了，该地区家禽类食品中分离到的沙门氏菌对喹诺酮的耐药性最为严重。通过对进化实验获得的喹诺酮类药物耐药诱导菌株，以天为单位的连续检测，我们发现喹诺酮耐药决定区内关键基因序列的单个靶基因位点的突变，和菌株对喹诺酮类药物产生耐药的时间节点稍有不同，往往是先出现耐药表型，才会检测到喹诺酮耐药决定区的靶基因位点的突变。进一步，利用原核链特异性转录组测序技术，分析识别差异表达基因291个，GO功能分析显示主要的生物学功能是“代谢过程”、 “结合”、“分子过程”等。而将差异表达基因进行KEGG Pathway分析,其中最具代表性的富集性通路有“细菌入侵上皮细胞”、“细菌趋药性”、“双组分系统”、“细菌分泌系统”、和“ABC 转运体”等。同时，又利用实时荧光定量qPCR技术，验证重点关注的差异表达基因，发现该类基因的表达量的变化和转录组测定的基因表达量的结果一致，更进一步确定了这些富集通路中起重要关联的基因。最后，通过构建原始敏感株和诱导耐药株的TolC基因缺失及回复株发现，在沙门氏菌产生喹诺酮类耐药的过程中，如果没有TolC基因的参与，将很难表现出对喹诺酮类药物的高水平耐药。通过项目的执行，发表SCI论文2篇（均为第一资助），出版细菌耐药研究相关专著3本，获批2实用新型专利。