细胞核靶向的富勒醇硬脂质纳米粒的辐射防护作用

电离辐射作用的"靶"主要是基因组DNA，所以在电离辐射的瞬间立即清除DNA周围的自由基是保护DNA免受损伤的基础，而关键的问题是自由基清除药物应当能够进入到细胞核内发挥作用。富勒烯的多羟基衍生物是良好的自由基清除剂，我们的预实验表明它可以快速通过细胞膜到达细胞浆内，但不能进入细胞核内。本课题拟通过高压乳匀方法，研制一种新型已烯雌酚-富勒醇硬脂质纳米粒（C60(OH)24-SLN-E），通过己烯雌酚与雌激素受体的特异性结合，高效率地将富勒醇载带到细胞核内，发挥其强大的自由基清除功能，直接保护DNA靶分子免受自由基的攻击。通过细胞和分子实验，证实其在细胞内具有独特的分布规律并能够保护DNA；通过动物实验证实其在辐射敏感的组织、器官有较多分布，并具有较强的辐射防护效果。本课题的研究将为开发具有自主知识产权的新型辐射防护药物提供理论与实验依据。

目的：研制一种通过己烯雌酚与雌激素受体特异性识别与结合将富勒醇高效地载带到细胞核内、高效清除自由基的新型己烯雌酚-富勒醇固体脂质纳米粒C60（OH）24-SLN-E。.方法：四丁基氢氧化铵（TBAH）催化法合成富勒醇，对产物进行表征；高压乳匀法制备C60（OH）24-SLN-E，并对其物理特征进行鉴定。激光共聚焦显微镜动态观察其进入细胞和细胞核内的量。MTT和CCK-8比色法检测纳米粒对V79细胞的毒性作用； ICR小鼠腹腔注射染毒，观察其成活状况、30天内体重变化、外周血细胞和主要脏器病理学变化。细胞克隆形成实验观察其对体外培养细胞的辐射保护作用；细胞γ-H2AX焦点分析，观察其对受照细胞DNA DSB形成的影响。6 Gy 60Co  照射SPF级ICR 雄性小鼠，观察腹腔注射不同剂量C60（OH）24-SLN-E后的辐射防护作用。.结果： FT-IR、1H-NMR和LC-MS分析制备的富勒醇, 证实产物为C60(OH)24；制备的C60(OH)24-SLN-E形态近似球形，直径300nm左右。共聚焦显微镜观察，包裹罗丹明-6G的C60(OH)24-SLN-E能够快速进入细胞，在细胞浆核内有明显浓聚。C60(OH)24 –SLN -E在浓度≤1.5µmol/L时，细胞生存率＞95%；小鼠高、中、低三个剂量（100、10 1µg/Kg）染毒后30天内，未见动物死亡，与对照组比较，外周血细胞成分无明显变化（p>0.05），小鼠体重无明显变化（p>0.05），肝、肾、脑和骨髓等无明显病理变化。克隆形成实验表明，照射前30min向培养液中加入C60(OH)24–SLN -E（终浓度1.27μmol/L），细胞存活分数高于单纯照射组（p<0.05）；加药组受照细胞γ-H2AX焦点数以及核内荧光强度少于单纯照射组（p＜0.05）。腹腔注射200μg/Kg C60(OH)24 –SLN –E，照后2-14天小鼠体重明显高于单纯照射组(p<0.05)，在第14天，外周血细胞特别是白细胞数量恢复正常，与对照组和单纯C60(OH)24用药组有显著差异（p<0.01）。 .结论：成功研制了细胞核靶向的C60(OH)24 -SLN-E，可将富勒醇载带到细胞核内，细胞和动物实验表明，它低毒并具有明显的辐射防护效果,有可能发展成为特殊高效辐射防护药物。