凝血因子XII抑制剂的理性设计及其抗血栓活性研究

Thrombotic disease is a leading cause of death worldwide. Existing antithrombotic drugs all result in side-effect haemorrhage, impairing treatment. A large amount of experimental and clinical data indicate that coagulation factor XII (FXII) promotes thrombosis, although the absence of FXII gene would not affect the physiological hemostasis. Therefore, FXII inhibitors are promising antithrombotic drugs without bleeding risk. Currently, FXII inhibitors under development possess drawbacks. Crystal structure of active FXII (FXIIa) could provide a basis to rationally design efficient inhibitors. The applicant has worked in the field of fibrinolytic hydrolase and inhibitors for a long time and designed a variety of inhibitors. In this project, we will determine the crystal structure of FXIIa, develop peptide inhibtors of FXIIa based on this structure, study their inhibitory mechanism, and evaluate their antithrombotic effect and side effects in vivo.

血栓性疾病是危害人类健康的头号杀手。现有的抗血栓药物都具有出血性副作用，不利于对血栓性疾病的防治。大量的动物实验和临床数据表明：凝血因子XII（FXII）能够促进血栓的形成，但FXII基因的缺失不会影响正常的止血功能。因此，FXII的抑制剂有望成为无出血性副作用的抗血栓药物。当前还处于研发阶段的FXII抑制剂均存在一些缺陷，尚未进入临床试验。活性FXII（FXIIa）三维结构的解析将为理性设计FXIIa特异性高效抑制剂提供坚实的结构基础。申请人在纤溶系统水解酶及抑制剂领域开展了多年的结构和功能研究，发展了多种抑制剂。本项目拟解析FXIIa的晶体结构，并基于该结构开发FXIIa的多肽类抑制剂，研究抑制机理，并评价抑制剂在体内的抗血栓功效和副作用，力争筛选得到靶向FXIIa的特异性高效抑制剂。

背景：血栓性疾病是危害人类健康的头号杀手。目前上市的抗血栓药物普遍具有出血性副作用，严重的出血会危及生命。凝血因子XII（FXII）能够促进血栓的形成，但FXII基因的缺失不会影响正常的止血功能。因此，FXII的抑制剂有望开发成无出血性副作用的抗凝药物。当前研发的FXII抑制剂均存在一些缺陷，尚未进入临床试验。基于活性FXII（FXIIa）的三维晶体结构能够理性设计FXIIa特异性高效抑制剂，进而开发出无出血性副作用的抗血栓药物。. 内容：本项目在实施过程中，围绕FXIIa开展了一系列工作：1、利用酵母表达体系对FXIIa进行了大量表达,并进行了纯化、酶学鉴定、凝血功能验证和蛋白结晶；2、以本项目所获得的FXIIa蛋白为基础，进行了FXIIa抑制剂的实验筛选；3、以FXIIa的晶体结构为基础，进行了FXIIa抑制剂的计算机高通量辅助筛选，并对筛选到的潜在抑制剂进行了酶学测试；4、将内容2和3筛选得到的有效抑制剂进行了体外抗凝功能验证，并进行了初步的动物水平实验；5、以血管内皮细胞为模式细胞，通过siRNA技术和深度测序方法，对FXII基因进行了表观遗传学研究。此外，本项目还通过计算机模拟研究了多种上市抗凝药物与人血清白蛋白的相互作用机制。. 结果和关键数据：1、获得了大量高纯度具有完成活性的FXIIa蛋白；2、成功获得了多种具有体外和体内抗凝效果的FXIIa抑制剂；3、获得了血管内皮细胞FXII基因的表观遗传学初图；4、通过计算模拟分析得到了三种新型抗凝药物与人血清白蛋白相互作用的动力学参数。. 科学意义：1、本项目通过酵母表达体系获得的大量高纯度人源FXIIa蛋白，一方面为FXII抑制剂的开发提供了坚实的物质基础，另一方面也为富含二硫键蛋白的工业化生产提供了可借鉴的方法学；2、本项目将计算机高通量药物筛选与经典活性测试相结合，成功筛选到了FXIIa抑制剂，并证明这些抑制剂具有体外和体内抗凝效果，这些抑制剂有望开发成新一代的抗凝药物；3、本项目通过分析血管内皮细胞中FXII基因的表观遗传学图谱，可为下一步的血栓性疾病的基因治疗提供思路；4、本项目通过分析上市新型抗凝药物与人血清白蛋白的相互机制，为理性改造、优化这些药物提供了理论依据。