HER4通过调控自噬保护骨肉瘤细胞逃避凋亡的机理研究

Resisting cell death is one key hallmark of cancer. The ERBB receptor tyrosine kinase family member HER4 may play important pretoective role in osteosarcoma. Our previous work suggested that HER4 protects osteosarcoma cells from cellular stress and avoid apoptosis. HER4 may be related to the regulation of autophagy. Inhibition of HER4 decreased lung metastasis. We hypothesized that the function of HER4 to regulate cell autophagy is key to these findings.. Based on the above observation, the purpose of this proposal is to determine which functional domain of HER4 is responsible for its protection effect in osteosarcoma. We want to analyze its potential downstream pathways and interacting molecules that relate with anti-apoptosis effect. Second, we plan to analyze how HER4 regulates autophagy, and through which key moleculars. Further, we will also measure the impact of HER4 on lung metastasis and chemosensitivity in osteosarcomas. Our study will clarify the role of HER4 in survival of osteosarcoma. Our findings will test the possibility for HER4 to become a new therapeutic target for osteosarcoma.

抵抗细胞死亡是肿瘤的重要特性，也是肿瘤治疗失败的主要原因。ERBB受体酪氨酸激酶家族蛋白HER4对骨肉瘤可能具有重要的保护作用。本课题前期工作结果显示：HER4保护骨肉瘤在细胞应激状态下存活并抑制凋亡；HER4与调控细胞自噬水平有关；抑制HER4降低了骨肉瘤肺转移率，提示HER4对骨肉瘤细胞在不利环境下存活的重要性，然而其具体调控机理尚不明确。我们认为HER4可能通过调控自噬以保护骨肉瘤耐受细胞应激，从而逃避细胞凋亡。.基于以上工作基础，本课题拟通过一系列实验判断HER4在骨肉瘤中起保护作用的主导功能基团，并对其下游通路中可能与抑制凋亡相关的重要分子进行检测；对HER4调控自噬的通路和关键分子进行分析和验证；检测HER4对骨肉瘤肺转移和化疗敏感性的影响。本课题将解析HER4在骨肉瘤中维持肿瘤生存的作用机制，从而探讨HER4作为骨肉瘤治疗靶点的可能性。

背景 肿瘤细胞自噬和休眠是肿瘤自我调节能力的表现，也是肿瘤复发、转移和治疗失败的主要原因。方法 我们利用无血清培养和三维悬浮培养模拟肺转移早期体内血循环状态，利用流式检测细胞周期、SA-β-gal染色检测细胞衰老、GFP-LC3检测细胞自噬、western blot检测衰老标志蛋白p53，p21和p27；细胞周期G0/G1期标志蛋白Cylin D1和CDK4；细胞自噬标志蛋白LC3B的表达；通过慢病毒构建HER4稳定表达细胞系，软琼脂单克隆和台盼蓝染色检测细胞增殖；SA-β-gal染色检测细胞衰老和摄透电镜观察自噬的超微结构检测自噬水平变化；进一步二维凝胶电泳检测HER4敲除后，细胞蛋白表达变化；分别运用western blot和RT-PCR检测干扰HER4后，NDRG1的蛋白和mRNA表达变化；再采用上述方法检测NDRG1是否调节肿瘤细胞衰老和细胞自噬；通过原位胫骨原位注射，构建裸小鼠没转移模型，检测HER4和NDRG1的肺转移率。结果 无血清培养和三维悬浮培养条件下，可以诱导细胞衰老和细胞自噬；抑制HER4的表达，可以抑制细胞增殖、诱导细胞衰老、降低细胞自噬水平；抑制HER4的表达可以降低细胞内NDRG1的表达水平，反之，抑制NDRG1的表达也可以降低HER4的表达水平；无血清培养和三维悬浮培养条件下，NDRG1的表达水平上调；抑制NDRG1的表达可以诱导细胞衰老，抑制细胞自噬，增加细胞凋亡；体内动物实验证明：抑制HER4和NDRG1都可以降低骨肉瘤肺转移率。结论 无血清培养和三维悬浮培养模拟肺转移，骨肉瘤细胞上调细胞HER4和NDRG1的表达水平，调控细胞周期、细胞衰老和细胞自噬，诱导细胞进入休眠状态，保护细胞耐受应激，免于凋亡和衰老，增加转移潜能。