柑橘中典型手性杀菌剂降解行为及P450 酶介导下代谢分子机制研究

China is one of the origins of citrus. currently it’s the biggest country for citrus planting area and output rank in the world. In the process of citrus production, processing, storage, transportation and sale, fungicides are usually used to control the disease and reduce the decay. In this research project, the selective behavior of the enantiomers of prothioconazole and imazalil in the growth and storage of citrus was studied，to reveal regular pattern of degradating，transforming，enriching and metabolizing for different enantiomers.Using P450 enzyme-mediated in vitro cell model and high-resolution mass spectrometry to analyze the molecular structure of metabolites, and to investigate the toxicity differences between the enantiomers and their metabolites of prothioconazole and imazalil on normal HepG2 cells and cells transfected with HepG2 cells. Based on experimental and molecular simulation results, reveals the molecular mechanisms of metabolic activation/detoxification of chiral pesticides, providing a theoretical basis of the safety assessment of chiral pesticides. It’s very important to food safety，people's health, and protecting the environment for guiding the rational use of drugs, minimizing and controlling residual pesticides.

我国是柑橘原产地之一，目前种植面积和产量均居世界第一。在柑橘生产、贮藏、运输和销售过程中，通常使用杀菌剂来控制病害、减少腐损。本项目通过开展丙硫菌唑和抑霉唑对映体在柑橘生长及贮藏过程中选择性行为研究，揭示不同对映体在柑橘生长及贮藏过程中的降解、转化、富集和代谢规律；利用P450 酶介导的体外细胞模型和高分辨质谱等手段，解析代谢产物的分子结构，探讨丙硫菌唑和抑霉唑对映体及其代谢产物对正常HepG2细胞和转染 HepG2细胞的细胞毒性差异。基于实验和分子模拟结果，揭示手性农药的代谢活化/解毒的分子机制，为手性农药的安全评价提供理论依据。这对指导柑橘生产上合理用药，最大限度地降低、控制残留农药，对保障食品安全和人们健康及保护环境均具有重要意义。

抑霉唑在柑橘贮藏过程中具有选择性降解行为，其中S-抑霉唑在柑橘全果和果皮中的降解速率快于R-抑霉唑，代谢产物S-咪唑乙醇在果实中的积累显著高于R-咪唑乙醇。丙硫菌唑仅在露地栽培的柑橘果皮中有选择性，R-丙硫菌唑优先降解。两种栽培(露地和大棚)模式下，丙硫菌唑代谢产物硫酮菌唑对映体的积累均以R-硫酮菌唑为主，积累到峰值后开始降解，而S-硫酮菌唑发生降解的时间比R型更早，且均符合一级动力学方程。抑霉唑对映体在人肝微粒体(HLM)P450 酶介导的代谢无选择性，代谢产物S-咪唑乙醇的积累有选择性，且显著高于R-咪唑乙醇。S-抑霉唑在小鼠肝微粒体(MLM)P450 酶介导下的代谢快于R-抑霉唑，代谢产物S-咪唑乙醇优先积累，这与HLM结果相似。在肝微粒体中的选择性主要是和CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1，CYP4B1，CYP1B1，CYP4X1一种或几种共同的亚型有关。R-丙硫菌唑，R-硫酮菌唑在MLM P450 酶介导下的代谢速度分别快于S-型，而在HLM中S-丙硫菌唑，S-硫酮菌唑的代谢速度则比R型更快，表现出相反的选择性降解行为；R-硫酮菌唑在MLM和HLM中的积累速度均快于S-硫酮菌唑，这可能和CYP450 酶中人和小鼠不同的亚型起作用有关，如 CYP2、CYP3等亚家族。通过酶动力学研究发现，S-抑霉唑在MLM和HLM CYP450酶最大反应速率均高于R-抑霉唑，其中一种或几种共同的亚型对S-抑霉唑的结合力要强于R-抑霉唑。R-丙硫菌唑、R-硫酮菌唑在MLM CYP450酶中的最大反应速率分别高于S-型；因CYP450 酶中人和小鼠不同的亚型起作用，在HLM CYP450酶中S-丙硫菌唑、S-硫酮菌唑的最大反应速率分别高于R-型。同时本项目也初步探索了抑霉唑和咪唑乙醇对映体在人CYP1A1和人CYP3A4作为对接受体的代谢分子机制。R-对映体结合这两种CYP蛋白更紧密，因此在以人CYP1A1和人CYP3A4起主导作用的情况下，R-对映体的代谢比S-对映体更快，作为CYP酶氧化小分子的重要结合位点，铁卟啉环Fe离子与杂环吸电子基团N的距离对氧化代谢的影响至关重要。