梨花粉管质膜钙和钾通道活性及其对自交不亲和性的调控机制

Based on the study of pear pollen tube plasma membrane ion channels, we used multiple techniques including in patch clamp, laser confocal microscopy, immunoblotting and fluorescent labeling to study the collaborative regulation mechanism(s) of pear pollen tube plasma membrane ion channels with other signaling molecules in controlling pollen germination and pollen tube growth. The main research includes the pear pollen tube plasma membrane calcium and potassium channels gene cloning; the regulatory mechanism(s) of signaling molecules such as cyclic nucleotide on pear pollen tube plasma membrane calcium channel activity; the relationship between calcium signaling and actin cytoskeleton structure, vesicle movement in pear pollen tube; the regulatory mechanism(s) of signaling molecules such as heme on pear pollen tube plasma membrane potassium channel activity; the regulatory mechanism(s) of compatible and incompatible S-RNase on pear pollen tube plasma membrane calcium and potassium channels activity, as well as the effect of opening and closing of pear pollen tube plasma membrane calcium and potassium channels on the incompatible S-RNase-induced alterations of cytosolic calcium concentration, actin cytoskeleton structure and vesicle movement. These studies will help us further understanding of the signal transduction of pear pollen tube plasma membrane ion channels, and promote the interdisciplinary scientific problems research between pomology and cell biology.

在对梨花粉管质膜离子通道活性研究的基础上，综合应用膜片钳、激光共聚焦显微镜、免疫印记及荧光标记等研究手段和技术，从信号分子与信息传递、生化代谢及超微结构等层面深入研究梨花粉管质膜离子通道与其他信号分子对梨花粉萌发与生长的协同作用机制。主要内容包括梨花粉管质膜钙和钾通道基因的克隆；环核苷酸等信号分子对梨花粉管质膜钙通道活性的调控机制；梨花粉管胞内钙信号与花粉管细胞微丝骨架、囊泡运动等的关系；血红素等信号分子对花粉管钾通道活性的调控机制；亲和与不亲和S-RNase对花粉管钙和钾通道活性的调控特性，以及钙和钾通道的开关对自交不亲和反应引起的花粉管胞内自由钙浓度、微丝骨架、囊泡运动变化等的影响。这些问题的解决将进一步明确梨花粉管质膜离子通道的信号转导机制，填补该领域的一些理论和技术的空白，对于拓宽果树生殖生理与细胞生物学的研究方向，推动对果树学及细胞生物学学科交叉科学问题的探讨具有一定的意义。

本研究为阐明梨花粉质膜钙和钾通道活性及其对自交不亲和性的调控机制，综合运用生物信息学、膜片钳和激光共聚焦等研究手段，从信号分子与信息传递、生化代谢等层面开展研究，取得如下进展：.1. 在梨全基因组测序的基础上，通过生物信息学等方法，获得了梨花粉质膜环核苷酸门控钙通道（CNGC）、谷氨酸类受体门控通道（GLR）和渗透压敏感型钙离子通道（OSCA）的基因。探明环腺苷酸直接、而鞘胺醇-1-磷酸通过异三聚体G蛋白间接调控梨花粉质膜钙通道的功能特性。发现分别用钙离子载体A23187和钙离子螯合剂EGTA处理，梨花粉管微丝骨架均发生解聚的现象，表明花粉管细胞骨架的结构对胞内钙离子浓度非常敏感。利用苯乙烯基荧光探针FM4-64标记，发现梨花粉管尖端的囊泡结构特征，为进一步研究梨花粉管生长过程中的吞排运动奠定了基础。.2. 探讨了梨CHX16调控胞内pH稳态的作用特性，阐明了CHX家族蛋白在花粉管生长中的作用。鉴定了梨花粉质膜上对胞内钙浓度敏感的外向钾通道。发现血红素代谢产物一氧化碳激活该通道开放率，该反应需要氧气的参与。发现NHX是位于液泡膜上的Na+(K+)/H+离子逆转运蛋白，在花粉管生长发育中起着重要的作用。.3. 研究了外源钙调素对自交不亲和花粉管生长的作用。发现外源钙调素能够促进梨花粉管生长并缓解不亲和S-RNase对花粉管生长的抑制；明确外源钙调素促进自交不亲和花粉管胞内钙离子浓度升高。利用膜片钳技术发现钙调素增加花粉管内钙离子浓度是通过调节细胞膜上的超极化激活钙通道实现的。同时，利用激光共聚焦显微镜发现外源钙调素能够维持自交不亲和过程中花粉管内的尖端ROS梯度与细胞骨架结构的稳定。