靶向诊疗一体化纳米分子探针用于视网膜母细胞瘤多模态显像及治疗的研究

Nanomolecular probes have shown great potential in tumor imaging and therapy. However, there are still serious defects such as insufficient targeting, and the difficulty to integrate imaging and therapy together. Therefore, the research on the development of new multi-functional nanomolecular probes to achieve the integrated diagnosis and therapy of tumors has attracted much attention. Considering the urgent demand of retinoblastoma (RB) in early diagnosis and noninvasive therapy, based on the important previous research foundation, we aimed to develop a RB Y79 cells targeted, PFH/ICG, wrapped, Fe3O4-loaded, phase-transition multifunctional molecular probe(FA-PFH-ICG-Fe3O4-NPs). Owing to the strong folate-magnet dual targeting ability, the probe can penetrate barriers of the cell membrane and the extracellular matrix and concentrate largely around RB cells. By virtue of the laser technology which is commonly used in ophthalmology, nondestructive imaging of photoacoustics, ultrasound and MR will be acquired as a result of phase-transition of the probe coating PFH and ICG. Meanwhile, under laser irradiation ICG will convert light energy into heat energy and generate a large amount of ROS, taking advantage of its photothermal and photosensitive properties, thus the probe can exert the photodynamic and photothermal therapy effect synergetically. By exploring the optimal condition of imaging and treatment in vitro and in vivo, it will provide new insight to construct a safe and non-invasive theranostic system to realize early diagnosis, efficient treatment and visual evaluation of RB.

纳米分子探针在肿瘤显像与治疗方面显示了诱人的前景。但仍存在靶向不足，显像与治疗难以同步整合的严重缺陷，因此，研发新型的多功能纳米分子探针，实现肿瘤的一体化诊疗是目前研究的热点。鉴于视网膜母细胞瘤（RB）在早期诊断及无创治疗方面的迫切需求，本课题基于重要前期研究基础，拟研发一种叶酸-磁双靶向、包裹液态氟碳（PFH）和吲哚箐绿（ICG），同时载Fe3O4的相变型多功能纳米分子探针(FA-PFH-ICG-Fe3O4-NPs)，在磁场作用下，使其大量富集于RB细胞，激光作用下通过光致相变获取其超声、光声及核磁共振图像，实现对肿瘤的精准定位；同时ICG将吸收的光能转化为热能，并产生大量活性氧，发挥光热及光动力协同治疗效应。通过探索体内外显像与治疗的最佳条件，为构建一种集RB早期诊断、治疗及疗效评价于一体的安全、高效、无创的可视化诊疗体系提供新思路。

本实验通过薄膜分散-超声双乳化法成功构建了叶酸-磁双靶向、包载吲哚菁绿（ICG）、全氟己烷（PFH）、油酸修饰的四氧化三铁（Fe3O4）的阳离子脂质体FA-CN-PFH-ICG-Fe3O4 (FCNPIFE) 纳米粒。透射电镜下可见纳米粒成功合成，具有良好的分散性和均匀的尺寸。马尔文粒度分析仪测得FCNPIFEs的平均粒径为 338.63±10.90 nm，zeta 电位为 31.86±3.49 mV。通过紫外分光光度法和ICP-OES分别测得ICG和Fe的包封率为93.09 % ± 0.63 %、4.37 ± 0.80 %。FCNPIFEs具有超顺磁性。FCNPIFEs在808nm激光下能发生光致相变，纳米粒充氧后表现出良好的储氧能力。FCNPIFEs在体内外均具有良好的叶酸/磁性双靶能力，体内外实验证实FCNPIFEs在3h即能在视网膜母细胞瘤Y79细胞/皮下移植瘤中大量聚集。FCNPIFEs在体内外均能实现超声/光声/磁共振三模态成像，且成像的信号强度与浓度均存在线性关系，这说明FCNPIFEs不仅可以在肿瘤区域实现高效积累，还具备多模态成像造影剂功能。由于ICG的光热性能，FCNPIFEs在808nm激光下能迅速升温，升温趋势和纳米粒浓度以及激光功率成正比，此外，FCNPIFEs还具有良好光热稳定性。通过共聚焦和流式细胞术分析FCNPIFEs在缺氧和常氧条件下均具有光动力性能，其强度不受缺氧影响。CCK-8验证了在RPE和Y79细胞中，没有激光激发的FCNPIFEs不存在明显的细胞毒性。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析，FCNPIFE在Y79细胞中具有光热治疗（PTT）和光动力治疗（PDT）的协同治疗作用。对视网膜母细胞瘤（RB）皮下移植瘤瘤鼠进行治疗发现，PTT/PDT组具有优异肿瘤抑制效果，协同治疗效果显著优于单一治疗，且没有明显的全身毒性。通过PTT/PDT协同治疗的机制研究，发现封装在FCNPIFEs中的PFH可以确保在缺氧条件下补充氧气，从而降低HIF-1α表达，增强光动力效应；PDT可以降低PTT治疗过程中HSP70表达。治疗结束时对各组主要脏器HE染色，并通过血常规、肝肾功分析表明纳米粒具有良好的体内生物安全性。本研究结合了眼科和超声领域，设计的多功能FCNPIFEs在临床应用中显示出良好潜力，为视网膜母细胞瘤的早期诊断和治疗提供了新思路。