硒调控、RNA干扰与基因转染超表达研究睾丸硒蛋白V功能及亚细胞定位

硒蛋白是一类含硒代半胱氨酸并大都有氧化还原特性的蛋白质，在自由基清除、激素代谢、精子成熟等生命活动中发挥重要甚至关键作用。迄今发现的25种硒蛋白中，硒蛋白V（SelV）仅在睾丸生精细胞表达且功能未知。本项目拟以体内、外实验研究SelV表达特征和生物学功能。动物实验中，以硒（Se）缺乏、适量、过量的饲料分别喂养3组雄性大鼠至性成熟后取样，定量PCR和免疫印迹法分析睾丸组织和精子中SelV mRNA丰度和蛋白质含量差异；观察并分析生精小管、精子形态和精子发生过程的差异。体外实验中，分别以不同Se水平、RNA干扰和基因转染超表达3种途径研究SelV异常表达对大鼠生精细胞增殖、分化、形态及硒酶活性的影响，对比分析体内、外环境下Se对生精细胞SelV表达的调控机制；以荧光蛋白-SelV融合表达分析SelV亚细胞定位，并测试SelV潜在的酶活性。研究结果有望深入认识Se及SelV与雄性生殖功能的关系。

硒蛋白V（SelV）是较晚发现的一批硒蛋白之一，它主要表达于睾丸组织，并推测与雄性生殖功能密切相关。本项目旨在通过体内外实验，对SelV进行功能研究，主要发现如下：（1）用探针法定量PCR检测证实SelV主要在睾丸组织表达，在其它组织的信号极弱，几乎无法比较组间差异；不同硒饲养大鼠的睾丸SelV表达水平无显著差异，而Gpx1、Txnrd1等9个硒蛋白的表达则有显著差异。原核表达了大鼠SelV蛋白肽段，并用于制备抗体。Western blot证实了SelV蛋白表达在睾丸组织的稳定性，且在肝组织无法有效检测到信号。（2）4个染硒组中，5.0ppmSe组精子畸形率最高，达48.7%，缺硒对照组其次，为40.2%，0.25ppmSe组和3.0ppmSe组结果相近，分别是25.7%和25.9%。硒中毒组和缺硒对照组精子超微结构损伤最严重，精子中尾段是损伤最严重部位，线粒体和细胞膜是损伤最严重的精子结构。另外，给予缺硒大鼠补充适量的硒（0.25ppmSe）可在一定程度恢复缺硒所致的精子超微结构损伤，但仍存留有部分损伤不可恢复，如线粒体丢失、空变现象。（3）利用人黑色素瘤细胞，通过shRNA干扰SelV表达发现：稳定转染A375细胞的SELV表达显著降低（P＜0.05），细胞增殖和细胞周期未发生明显变化，但细胞早期凋亡率、ASB9和OGT表达量显著增加（P＜0.05）。SELV可能与细胞凋亡的抑制有关。