霍乱弧菌二鸟苷酸环化酶VC2370和VCA0956的结构与功能研究

环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是一种广泛存在于细菌中的新型第二信使，参与调控细菌的多种重要的生理过程。c-di-GMP的合成和降解分别由二鸟苷酸环化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)完成。其中DGC催化活性由GGDEF结构域决定，PDE由EAL或HD-GYP 结构域决定。基于目前对DGC酶家族结构和功能的研究进展，我们的研究目标主要集中在阐明霍乱弧菌二鸟苷酸环化酶VC2370和VCA0956两个蛋白的催化机理。拟通过X-射线晶体学方法获取VC2370和VCA0956两个蛋白各自在三种状态下（自由态、结合底物、结合产物）的三维结构，通过结构比较、分析以及定点突变等实验确定VC2370和VCA0956蛋白的活性位点和别构位点，阐明它们的结构与功能的关系及它们的催化机理，探讨c-di-GMP信号通路的调控机制，为揭示细菌丰富而复杂的信号传导机制奠定基础。

C-di-GMP信号通路中相关蛋白质的结构与功能研究对于系统地阐明c-di-GMP信号传导系统具有重要意义。本项目利用生物化学和结构生物学手段，对霍乱弧菌二鸟苷酸环化酶VC2370和VCA0956进行了结构与功能的研究，最终取得了一系列的研究成果。首先我们完成了VC2370和VCA0956重组蛋白的高效表达与纯化，然后获得了apo-VCA0956（169-339）、VCA0956（169-339）-c-di-GMP复合物、VC2370 (399-579)-c-di-GMP复合物等的三套衍射实验数据，其分辨率分别为1.6 Å、2.7 Å和2.8 Å，最后完成了这些晶体的结构解析工作和相关酶活测定分析等实验。此外，我们还完成了c-di-GMP体外生物酶高效合成的技术和平台。根据结构与功能分析结果，我们提出了一些新观点：.1. VC2370和VCA0956蛋白的GGDEF结构域前面的结构域对蛋白的高效酶活起着重要的作用，并且也是活性二体化所必需的。.2. 根据VCA0956与c-di-GMP复合物的晶体结果，我们获得一个很有意思的截短体的突变体，该突变体能自动二聚化，但依然如单体的截短体一样只有残留酶活。这说明VCA0956蛋白的高效酶活不仅需要蛋白形成活性中心相连的二体，而且还需这种二体蛋白具有适度紧凑的结构。.3. VCA0956虽然没有经典的RXXD别构抑制motif，但其酶活依然可以被c-di-GMP抑制，且为竞争性抑制。.4. VC2370含有经典的RXXD别构抑制motif，其酶活可被c-di-GMP非竞争性抑制。.5. 根据VC2370与c-di-GMP复合物的晶体结果，我们设计了一系列突变体，筛选出一个突变体在体外仍保持野生型蛋白的高效酶活，但不再受产物c-di-GMP所抑制。..本项目的研究成果将以研究论文的形式在高水平的国际学术期刊上发表。本项目中的VCA0956的研究结果正在整理成文待投。..另外，本人也参与了“神经退行性疾病相关的重要蛋白Aprataxin同源物Hnt3的晶体结构研究”和“人体先天免疫相关蛋白STING与c-di-GMP的识别机制研究” 等两项研究，两篇文章均已发表在国际著名期刊Nature Structural & Molecular Biology上（本人均为并列第一作者）。