腺苷A2A受体调控线粒体OPA1加工对视神经萎缩保护作用分子机制的研究

Autosomal dominant optic atrophy is the most common hereditary optic neuropathy caused by mitochondrial OPA1 gene mutation without effective treatment. OPA1 is critical to the control of the final common pathway of cellular apoptosis (mitochondrial cytochrome C release). Based on our extensive studies of adenosine A2A receptor (A2AR)-mediated neuroprotection against various insults (including vision insults) and on our recent identification of OPA1 mutation in Chinese patients and of the A2AR control of OPA1 expression, we propose that the A2A receptor regulate mitochondrial cAMP/PKA pathway to control OPA1 processing and prevent ganglion cell apoptosis. We will first establish a novel animal model of optical neurodegeneration by AAV expression of OPA1 with the recurrent deletion mutation causing autosomal dominant optic atrophy in Chinese family. We will then determine the causal role of the A2AR in control of OPA1 expression and optic degeneration using genetic knockout of the A2AR and pharmacological blockade of the A2AR (both the specific A2AR antagonist KW6002 and non-specific adenosine receptor antagonist caffeine). Lastly, we will dissect out the signaling pathway (i.e. mitochondrial cAMP/PKA-proteinase pathway) whereby the A2AR control of OPA1 control processing and cellular apoptosis in cultured SH-SY5Y cells. The information derived from this study will provide the first direct evidence for the A2AR for controlling OPA1 processing and optical degeneration. As the A2A receptor antagonist drugs are under clinical phase III trial for neurological disorders, our finding may provide necessary preclinical data to rapidly translate the A2AR for the treatment of optic atrophy.

常染色体显性视神经萎缩由线粒体OPA1基因突变导致，是最常见的遗传性视神经疾病，无有效治疗药物。基于我们实验室长期研究证实A2A受体有广泛神经保护作用和OPA1作为调控细胞凋亡的最终共同通道之一（控制细胞色素C的释放），结合前期预实验证实A2A受体直接调控OPA1，提出工作假说，A2A受体影响线粒体cAMP/PKA通路，改变蛋白酶对OPA1加工，抑制神经节细胞凋亡。项目申请人从临床筛选到遗传三代OPA1致病突变，利用该OPA1致病突变建立视神经萎缩动物和细胞模型，结合基因敲除和药理学阻断方法明确A2A受体能否作为治疗视神经萎缩的新靶点减缓视神经萎缩；在细胞及整体动物水平阐明A2A受体调控线粒体cAMP/PKA通路, 改变OPA1加工分子调控机理。本研究的开展证明A2A受体为治疗OPA1突变所致视神经萎缩新靶点，有望将进入临床三期的A2A受体拮抗剂类药物快速拓展应用到临床用于治疗视神经萎缩。

腺苷A2A受体是非多巴胺受体治疗帕金森病主要靶点，阻断该受体对神经退行性疾病的保护作用已被广泛研究，但机制不明。腺苷A2A受体已在美国和日本临床用于治疗神经精神类疾病，因此该药物的安全性已经被证实，其用于临床治疗视神经萎缩有广泛的前景。由于神经退行性疾病有一个共同的特征就是线粒体功能异常，而线粒体OPA1被剪切为L-OPA1和S-OPA1对线粒体结构和功能的维持发挥重要作用。本研究通过玻璃体腔注射线粒体氧化磷酸化解偶联剂（CCCP），建立小鼠的视网膜线粒体损伤模型。研究发现，CCCP处理和OPA1剪切，ErK的磷酸化有剂量依赖关系，CCCP浓度越高S-OPA1和磷酸化的Erk蛋白量越高。同时， CCCP处理会导致视网膜神经节细胞数量及视网膜厚度减少，而A2A受体特异拮抗剂KW6002阻断A2A受体对CCCP诱导的视网膜损伤有保护作用，增加神经节细胞的数量和视网膜的厚度，同时抑制OPA1的剪切，但对Erk的磷酸化无影响。检测线粒体的含量和线粒体膜电位发现，CCCP处理后会导致视网膜线粒体含量降低，并破坏线粒体的膜电位，KW6002处理后会增加线粒体的含量，但不会改变线粒体膜电位。由于KW6002处理会抑制OPA1剪切，但是OPA1仅在神经节细胞，无长突细胞及水平细胞表达，通过TUNEL实验检测神经节细胞的凋亡，发现KW6002处理后会减少神经节细胞凋亡。因此，阻断A2A受体抑制OPA1剪切阻止神经节细胞的凋亡可能A2A受体发挥保护作用的机制之一。由于研究中还发现KW6002处理会增加线粒体的含量，提示还存在其它的机制。因此，我们利用全转录组测序，从CeRNA网络的角度进一步研究A2A受体的保护机制。结果发现，KW6002处理后会导致Bdnf mRNA的水平和成熟的Bdnf蛋白增加，提示KW6002处理增加成熟Bdnf蛋白量可能也是其发挥保护作用的机制之一。同时，A2AR阻断可使CCCP诱导的microRNA数量减少约60%，而使CCCP诱导的Circle RNA数量增加约50%, 提示A2A受体拮抗剂处理后会调控CeRNA网络影响mRNA表达也是其调控机制之一。本研究为阐明KW6002阻断A2A受体对视神经退行性疾病的保护作用机制，为将来A2A受体药物的临床应用提供了理论基础。