模拟失重下破骨细胞源性外泌体中调节骨形成相关miRNAs的筛选及功能研究

During long-term space flight, space bone loss is the primary risk factor which seriously threatens the health of astronauts. Bone loss is induced by regulation of astronauts' bone metabolism imbalance in the weightlessness environment. Osteoclasts are playing a key role in the regulation of bone metabolism. Our previous study showed that the osteoblasts function was regulated by osteoclasts via paracrine signaling under simulated weightlessness, and further results showed that bone formation activity of osteoblasts was inhibited by the exosomes derived from osteoclasts. Meanwhile, it has recently been shown that exosomal miRNAs are the key signal regulatory factors in regulation of bone metabolism. Based on the existing research, we propose the hypothesis that the exosomal miRNAs derived from osteoclasts may be the pivotal messager involved in the regulation of bone formation under simulated weightlessness. The present project aims to investigate the molecular mechanism of the osteoclasts derived exosomal miRNAs in the regulation of bone formation under simulated weightlessness on molecular-cell-animal levels. The experimental approach will be based on high-throughput sequencing and molecular-cell technology. This project will lay the research foundation and experimental evidence for space bone metabolism and prospectively provide new ideas and drug target for the therapy of space bone loss.

长期空间飞行中，失重性骨丢失已被列为影响航天员生命健康的首要风险因素。失重环境中，航天员体内骨代谢调控的失衡导致了骨丢失的发生。破骨细胞在骨代谢调控中扮演着重要的角色，申请者前期研究表明破骨细胞在模拟失重下可通过旁分泌途径调节成骨细胞的功能，进一步研究发现破骨细胞外泌体可抑制成骨细胞的骨形成。同时，国内外研究表明外泌体中的miRNAs对骨代谢有重要的调控作用。据此，我们提出了“模拟失重下破骨细胞外泌体miRNAs可能作为一种关键的信使参与骨形成的调控过程”这一科学假设。本项目拟利用尾悬吊、随机回转及抗磁悬浮分别建立模拟失重动物、细胞模型，采用高通量测序、分子细胞生物学等研究方法，从分子—细胞—整体各个层面揭示破骨细胞外泌体miRNAs在模拟失重下调控骨形成的分子机制。该研究将为深入理解空间骨丢失的发生机理提供理论基础和实验依据，并可望为空间失重性骨丢失的防治提供新的思路和药物作用靶点。

长期空间飞行中，航天员体内骨代谢调控的失衡导致了骨丢失的发生。破骨细胞对成骨细胞的调控机制是骨代谢研究领域的重要研究方向之一。本项目以破骨源性外泌体作为切入点，研究了模拟失重下破骨源性外泌体对成骨细胞的影响，并利用高通量测序技术对破骨源性外泌体miRNAs进行测序，构建了破骨源性外泌体miRNAs表达谱，进一步差异miRNA进行了靶基因预测及生物信息学分析，并对其中关键的miRNA开展了细胞水平的验证实验，并建立了模拟失重尾悬吊动物模型，进行了目标miRNA的验证实验。本研究实验结果表明：（1）模拟失重实验组显示出更高的酸性磷酸酶（TRAP）活性，而对照组的TRAP活性均较低；流式细胞术、Western blot、电镜及粒径检测等实验表明成功提取和制备了破骨源性外泌体；通过PKH67染色实验证实成骨细胞可以摄取破骨源性外泌体，模拟失重组破骨源性外泌体明显抑制MC3T3-E1细胞的增殖，且呈剂量依赖性；模拟失重组破骨源性外泌体处理MC3T3-E1细胞后其碱性磷酸酶活性明显降低，细胞周期被阻滞在G0 / G1期，且细胞形成的矿化结节明显减少；模拟失重组破骨源性外泌体可以诱导MC3T3-E1细胞的早期和晚期凋亡并进一步下调了成骨分化相关基因表达水平。（2）模拟失重破骨源性外泌体miRNAs的表达谱测序结果筛选出显著性差异表达的116个miRNAs，其中有29个表达上调，87个表达下调。（3）筛选出的10个骨形成相关差异表达的miRNAs，通过生信分析确定了各个miRNAs的候选靶基因；GO功能分析确定了候选靶基因的生物过程、细胞组成和分子功能；KEGG通路富集到5个骨代谢相关信号通路； RT-qPCR的验证结果与miRNAs测序结果高度一致。（4）研究了目标差异miR-27a-3p对前成骨细胞MC3T3-E1的调控作用，其结果表明其对成骨细胞增殖、分化功能具有明显的促进作用。（5）成功建立了小鼠尾悬吊建立骨质疏松模型，各项评价指标的结果表明可用于后期目标miRNA的动物实验研究。本项目研究为进一步阐明破骨细胞通过旁分泌机制调节成骨细胞的分子机制以及空间失重性骨丢失的防治提供新的思路和实验依据。