Ⅰ型和Ⅱ型几丁质酶在舞毒蛾发育过程中的功能及其杀虫效应研究

昆虫几丁质酶是分解昆虫体壁和中肠围食膜等组织内几丁质的重要水解酶类，通过昆虫几丁质酶调节昆虫体内几丁质的结构和代谢平衡来防治农业害虫是很好的生物防治策略。本研究拟以我国农业重要害虫舞毒蛾为对象，在前期研究基础上克隆Ⅰ型几丁质酶(LDCH1)全长序列和Ⅱ型几丁质酶(LDCH2)关键序列，通过建立有效的反转录PCR检测体系和RNA干扰技术分析两类酶在舞毒蛾发育过程各阶段和各组织中的表达与功能；构建重组LDCH1和外源几丁质结合区（CBD）基因杆状病毒，结合体外酶活检测分析不同CBD 对LDCH1的增效作用和重组病毒杀虫活性。研究结果不仅可为深入认识昆虫几丁质酶功能提供有力实验证据，而且为合理有效利用该酶基因改造生物杀虫剂和获得高效转基因抗虫作物提供理论依据，对科学防治舞毒蛾虫害具有重要意义。

我们顺利完成了项目“Ⅰ型和Ⅱ型几丁质酶在舞毒蛾发育过程中的功能及其杀虫效应研究”中的基本内容，其中个别细节部分根据实际情况做了适当调整。昆虫几丁质酶是分解昆虫体壁和中肠围食膜等组织内几丁质的重要水解酶类，通过昆虫几丁质酶调节昆虫体内几丁质的结构和代谢平衡来防治农业害虫是很好的生物防治策略。本研究以农业害虫舞毒蛾为研究对象，克隆获得了编码阅读框为1737 bp的Ⅰ型几丁质酶(LdCHT5)全长cDNA序列（GenBank登录号：KP337328）和2057 bp的Ⅱ型几丁质酶(LdCHT10)关键序列；通过反转录PCR和荧光定量PCR等方法研究了两类酶基因在舞毒蛾幼虫发育过程中的转录特性，两类几丁质酶基因在4龄和5龄幼虫蜕皮前后转录活跃，Ldcht5和Ldcht10在6龄幼虫前肠和表皮中都转录活跃；RNA干扰实验结果显示，经LdCht5沉默处理的6龄幼虫和预蛹完成了从幼虫到蛹的蜕变，但在蛹到成虫的变态过程中因无法摆脱蛹的表皮而死亡，Ldcht10基因沉默后24.3%的舞毒蛾幼虫因无法完成蜕皮或化蛹而死亡；建立了以荧光底物4-MU-(GlcNAc)3为基础的体外酶活检测体系，通过昆虫细胞表达外源蛋白并分析了重组CBD几丁质酶及不同几丁质酶突变体的催化特征，结果显示该酶反应的最适pH为6.0， 在pH 6.5处有具最好的pH稳定性，最适温度为50℃，在45℃有较好的热稳定性；构建了重组病毒并进行了初步的杀虫效果实验，显示几丁质酶基因对重组病毒有一定的增效作用。研究结果为深入认识昆虫几丁质酶催化机制提供基础数据，也为合理有效利用该基因获得转基因作物和重组病原体提供理论依据。