基于1,6-消除反应的靶向性一氧化氮供体型抗肿瘤药物的设计、合成及生物活性研究

Our previous investigations indicate that the specific O2-protected diazeniumdiolate could be specifically activated by the high levels of reactive oxygen species (ROS) in cancer microenvironment, and selectively release Nitric Oxide (NO) via a 1,6-elimination reaction-mediated O2 cleavage of diazeniumdiolate, resulting in potent anti-cancer activity. Herein, a novel molecular mode of NO donating anti-cancer agent is proposed. The designed molecule including folic acid moiety (Navigator) could be recognized by the folate receptor over-expressing on the surface of cancer cells, and then is endocytosed into cells. Some specific groups (Trigger) connecting to O2 position of diazeniumdiolate could be activated by high levels of ROS, hypoxia in cancer microenvironment,or thioredoxin reductase over-expression in cancer cells, triggering 1,6-elimination reaction and subsequently leading to release of diazeniumdiolate anion moiety. The latter will spontaneously liberate large levels of NO (Warhead) and secondary amine (Amplifier) with alkylating activity, generating synergetic anticancer effects.Further biological studies include: in vitro and in vivo anti-cancer activity evaluation, NO release measurement, analysis of NO-involved metabolite (3-nitrotyrosine) for its concentration and distribution in cancer and normal cells, and mechanism study at molecule, cell and tissue levels. The main purpose for this project is to develop one candidate with the targeting and selective anticancer activity into pre-clinical study phase.

我们的前期研究发现，O2位特定保护的偶氮鎓二醇盐可被肿瘤组织中活性氧族（ROS）所激活，诱发1,6-消除反应，释放大量NO，产生靶向性抗肿瘤作用。在此基础上，本项目设计、合成新型NO供体型化合物，其分子结构中的叶酸片段能与肿瘤细胞表面叶酸受体结合（导航），通过内吞作用使药物进入肿瘤细胞；O2上的特定取代基再被肿瘤细胞内高水平的ROS、低氧或过表达的硫氧还蛋白还原酶等激活，诱发1,6-消除反应（引信），生成偶氮鎓二醇盐，继而释放大量NO（弹头）和具有抗肿瘤活性的仲胺片段（放大器），选择性杀伤癌细胞而不伤害正常细胞或组织。通过测定目标化合物体内外抗肿瘤活性和NO释放水平；考察其对相应靶标的选择性作用；分析NO及其代谢物（包括NO与肿瘤作用的产物3-硝基酪氨酸）在正常及肿瘤组织中的分布，评价化合物的肿瘤靶向作用；并分别从分子、细胞及组织水平研究化合物的抗肿瘤机制，期望发现一种靶向性的抗肿瘤药物。

研究表明，一氧化氮（NO）和肿瘤的发生、发展关系密切，高浓度的NO可以诱导肿瘤细胞凋亡，产生肿瘤增殖抑制作用的同时不易产生耐药，因此引起广泛的关注。但由于NO作为信使分子，其在体内具有多重生物活性，因此设计合成肿瘤靶向性（选择性）的NO供体化合物是研究一氧化氮供体型抗肿瘤药物的关键科学问题。我们利用肿瘤细胞微环境的特点（如高ROS水平，高氧化还原环境）设计基于1,6-消除反应的NO供体化合物4-5，11-13以及21；在此基础上再将上述供体化合物片段和具有被动肿瘤靶向的纳米载体或具有主动肿瘤靶向作用的抗体G7mAb偶联，得到复合物MSN-NOs（17-19）以及G7mAb-NO（20）。研究表明：化合物4和5可选择性地被肿瘤细胞内高水平ROS的微环境活化，苯硼酸酯并被氧化成酚后触发1,6-消除反应，从而释放出游离的偶氮鎓二醇盐，进一步释放出大量的NO，产生选择性的抗肿瘤作用；化合物11-13可以在肿瘤细胞中过量的谷胱甘肽（GSH）的作用下断裂二硫键，进一步触发1,6-消除反应，释放NO，抑制肿瘤细胞增殖；化合物21可以选择性地在肿瘤细胞中被激活同步释放NO和香豆素衍生物，后者产生的荧光可作为实时探针指示细胞水平的NO的释放；MSN-NOs化合物17-19可以被HL60细胞吞噬，并且在肿瘤中高浓度的GSH作用下释放大量的NO；而化合物20可以在抗体（导航）和肿瘤细胞表面抗原特异性结合后，并被肿瘤细胞内吞，进一步在肿瘤细胞内高浓度GSH的作用下释放NO（弹头）和具有抗肿瘤活性的仲胺片段（放大器），产生较强的抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的活性。裸小鼠移植瘤实验结果表明给药30天后20有效地抑制人肝癌细胞BEL-7402的生长，抑瘤率（重量）达到85%。通过本项目的实施，为靶向性NO供体抗肿瘤药物研究提供新的思路；此外，共发表SCI论文11篇，在药物化学权威杂志J. Med. Chem上发表5篇，培养硕士研究生3名，博士研究生1名。