黄河鲤肌间骨骨化相关基因的发掘及验证

In China, Yellow River carp is one of the most important freshwater aquaculture species, which is favorite by consumers. Nevertheless, the existence of abundant intermuscular bones which seriously affect its edible value and manufacturing procedure, severely restrict the whole development of common carp industry. To date, we have cloned the SOST gene associated with bone formation and pinpointed the important time nodes in the formation of intermuscular bone. The main contents of this project are: (1) In order to obtain functional genes related to intermuscular bone formation and tissue specific expression, we will analyze the differences in gene expression among six important time nodes during the development of intermuscular bone from the perspective of comparative transcripts. Literature investigation will be conducted to confirm the follow-up verification of candidate genes. (2) The total length of the candidate genes are cloned and used to construct the lentiviral vectors. These vectors are transfected into osteoblasts respectively, and the osteogenic ability changes are investigated before and after transfection. Then, the efficiency of osteoblast infection and the differential expression of candidate genes are observed and detected. (3) We will use CRISPR/Cas9 technology to knock down related genes in zebrafish. Then, we will observe the morphological development of fish, and detect the effects on the expression of genes related to bone formation. Finally we will determine the genes related to the formation of intermuscular bone, and lay the foundation to explore the mechanism of intermuscular bone formation and cultivate cyprinidae fish with non-intermuscular bones.

黄河鲤是我国最重要的淡水养殖种类之一，深受消费者喜爱。但黄河鲤体内大量肌间骨的存在，严重影响其食用价值和加工工序，进而制约了产业发展。目前，我们克隆了与骨骼形成相关的SOST基因并确定了黄河鲤肌间骨骨化的重要时间节点。本项目主要研究内容是：（1）从比较转录组的角度，分析肌间骨骨化过程中六个重要时间节点的基因表达差异，得到与肌间骨形成相关的功能基因，以及组织特异表达的基因。文献调研，确定候选基因进行后续验证。（2）克隆候选基因全长，构建慢病毒载体转染成骨细胞，对比转染前后成骨细胞成骨能力的差异。然后观察成骨细胞转染效率并检测候选基因表达差异。（3）在斑马鱼中，采用CRISPR/Cas9技术对相关基因进行敲除，观察鱼体肌间骨形态发育情况并检测基因敲除对骨骼形成相关基因表达的影响。最终确定调控肌间骨形成的1-2个关键基因，为探索肌间骨形成调控机制和培育无肌间骨鲤科鱼类奠定基础。

黄河鲤是我国最重要的淡水养殖种类之一，深受广大消费者喜爱。但黄河鲤体内大量肌间骨的存在，严重影响其食用价值和加工工序，进而制约了产业发展。本课题通过研究诸多因素对黄河鲤稚鱼肌间骨的染色效果影响，探明最佳的染色方法，并确定了黄河鲤肌间骨发育的关键时间节点。然后，在五个关键时间节点，取特定组织，提取总RNA，构建转录组数据库。从转录组水平比较和分析不同时期的基因表达差异。相邻阶段两两之间的差异表达基因数分别是4,121、1,735、28,307和1,605。GO富集和KEGG分析差异表达基因，结果发现多个阶段差异基因主要富集在MAPK，FOXO和ECM等与骨发育相关的信号通路上。通过文献调研确定，bmp基因家族、dlx4a、wnt3a、igf、wnt4a等与成骨细胞、破骨细胞、钙离子通路相关的基因在肌间骨发育过程中表达。通过部分基因在肌间骨发育中的定量表达趋势验证其功能。结果表明，促进骨骼发育的bmp基因家族、dlx5、col6、igf、gdf10等基因都在肌间骨发育的前两个或三个阶段表现出上调趋势，hsp90作为bmp2的拮抗剂表现出持续下调。随后，基于生物信息学对筛选到的部分基因进行系统发育分析，探究拷贝基因之间的进化关系。采用qRT-PCR和WB检测上述基因的mRNA表达水平及部分基因的蛋白表达水平变化情况，进行组织表达和定位分析。随后，采用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼受精卵中，对TGF-β、bmp-1a、bmp-1b、bmp3和bmp6等基因进行大规模敲除。观察鱼体胚胎及肌间骨形态发育情况，发现嵌合突变体中均有1/3胚胎体型出现了不同程度的骨骼畸形，bmp-1a和bmp6突变个体出现了肌间骨弯曲、多根肌间骨在同处生长或缺失等异常生长现象。因此，bmp-1a和bmp6基因与黄河鲤肌间骨的发育相关，可能是肌间骨骨化过程的关键基因。本研究为解析黄河鲤肌间骨骨化分子机制以及遗传机制提供研究基础，为无肌间骨鲤科鱼类新品种选育提供理论依据。