东北稻田生态系统蓝藻病毒（噬蓝藻体）基因多样性研究

Bacteriophages are the most abundant biological entities in the biosphere. They play important roles in regulating the succession of host communities, biological evolution and biogeochemical cycling. Recently, the researches on virual ecology in marine ecosystem going very rapidly, however, limited studies on virual ecology in terrestrial ecosystem, and the systemical research aimed at to discover the virual genetic diversity in Chinese terrestrial ecosystem was not reported until now. Therefore, in this project, the cultural-independent methods of molecular biological techniques are used to reveal the gene sequences of g20 encodes the capsid assemblage protein of cyanomyoviruses and psbA of photosynthetic gene of cyanophages in the paddy fields in Northeast China, and the distribution patterns of those genes in paddy fields between Northeast China and Japan, and among paddy fields, marine and lake environments are systemical analyzed. In addition, aimed at to discover the corresponding relationship between cyanobacteria and cyanophages, the methods of isolation and purification of cyanophages, and inoculation of host-cell-free virual solutions to 13C-labelled cyanobacteria, and marked gene sequences of 13C-labelled cyanophages are also analyzed in this project. Generally, throught this study, new cyanophages genes in paddy fields in Northeast Chian will be discovered and novel cyanophage groups will be designed. This project will help us to discover the biogeographic distribution of cyanophage genetic diversity, and make the basic contributions to the development of molecular viral ecology.

细菌病毒是生物圈中数量最多的生物，在控制寄主群落演替、生物进化和地球生物化学循环中起到重要的作用。近年来，海洋生态系统病毒生态学研究进展很快，但陆地生态系统病毒生态学研究少有报道，特别是针对我国陆地生态系统病毒基因多样性研究还是空白。为此本项目以东北稻田为研究对象，以蓝藻病毒为研究目标，采用非培养的分子生物学技术解析稻田eDNA中蓝藻病毒标记基因g20和psbA多样性，揭示这些基因在东北稻田中的分布规律及蓝藻病毒群落结构特征；采用培养法分离、纯化蓝藻及蓝藻病毒，测定其相关基因序列，及稳定性同位素13C标记技术，解析蓝藻与蓝藻病毒间基因对应关系；通过构建系统进化树和UniFra分析，明确蓝藻病毒基因在稻田与其他环境中的分布异同，揭示蓝藻病毒基因分布与环境之间的关系。预计该研究将发现新的稻田蓝藻病毒基因，建立新的病毒类群，丰富学术界对蓝藻病毒基因多样性的认识，促进分子病毒生态学科研究的发展。

细菌病毒是地球上数量最多的生物，在控制寄主群落演替、生物进化和地球生物化学循环中起到重要的作用。但相比其他具有细胞结构的微生物而言，我们对细菌病毒遗传基因多样性的认识还很少。本项目从东北吉林大安（盐碱土）、黑龙江林甸（草甸黑钙土）、阿城（黑土）、绥化（黑土）和建三江（白浆土）等长期种植水稻的稻田采集土壤和田面水样品，采用原位样品分析和模拟培养的方法，以蓝藻病毒为研究目标，采用非培养的分子生物学技术，对上述稻田蓝藻病毒几种分子标记基因组成进行解析，揭示出东北稻田蓝藻病毒基因多样性及其分布特征。.从稻田水体中获得54条蓝藻病毒g20基因，其中30条序列形成3个新的蓝藻病毒g20类群，命名为PFW-VII~- IX，剩余的16条g20基因序列分组地位未明确。UniFrac分析揭示出中国东北稻田蓝藻病毒群落结构与日本稻田土壤和田面水中的蓝藻病毒群落结构不同，差异显著。进一步分析发现稻田g20基因群集与海洋和湖泊环境不同。.从稻田水体中获得136条蓝藻病毒psbA光合基因，再次证明稻田中一些蓝藻病毒含有光合基因。发现东北稻田蓝藻病毒psbA基因分布与日本稻田相似，主要集中分布在Cluster α-2，表明稻田环境中蓝藻病毒psbA基因在系统进化中的分布范围很窄。建立了7个新的稻田蓝藻病毒psbA分布群，命名为PW1~PW7。构建的系统进化树表明，稻田环境中蓝藻病毒psbA基因分布与湖泊中的亲缘关系较近，而与海洋中的亲缘关系较远。.首次报道了稻田T7型蓝藻病毒DNA 聚合酶基因（DNA pol）和蓝藻病毒磷营养调控基因（phoH）多样性。从稻田生态系统获得481条DNA pol基因和424条phoH基因，建立9个全新的稻田DNA pol基因群和4个新的细菌病毒phoH基因群，发现稻田蓝藻病毒DNA pol和phoH基因群集存在地域差异，由两个基因群集表征的稻田蓝藻病毒群落结构与海洋环境差异明显。另外，我们还采用切向过滤、酶处理和超离心等方法分离纯化稻田水体病毒，采用MDA方法扩增病毒宏基因组，利用高通量测序技术解析病毒宏基因组组成。.此外，我们还采用PCR-DGGE、构建克隆文库和分离培养等技术对东北稻田蓝藻群落结构进行解析，3种研究方法均表明东北稻田蓝藻群落结构复杂，存在许多未知的蓝藻种类。.本项目结果已发表SCI检索论文5篇，核心期刊论文4篇。