GRASPs蛋白在高尔基体囊膜堆叠中作用的结构基础和分子机理

The Golgi apparatus is comprised of stacks of flattened cisterneas and maintains its characteristic structure in spite of high dynamic vesicular traffic. It plays the key role in the protein secreting, sorting and trafficking in eukaryotic cells，but the molecular mechanisms responsible for its assembly and organization remain poorly understood. Our preliminary result indicates a new interaction between the PDZ domain of GRASP55 and a special peptide. This interaction can alter the structure of GRASP55 and form a network like structure. It may relate to the transition of Golgi in the stacking process. This project proposes to study the interaction between GRASP55 and this special peptide by mutagenesis based on this new discovery. In addition, we plan to solve the complex structures of the GRASP55 PDZ domain with golgin 45 and GRASP65 PDZ domain with the peptides derived from GM130 which was reported binding to the GRASP domain at the position similar to the interaction site in our new structure. The aim of this study is to understand the structural basis and molecular mechanism of Golgi cisternae stacking mediated by GRASPs by analyzing the conformation change and molecular rearrangement in all 3 complex structures and the related change of Golgi complex showed by immunofluorescence and EM techniques.

高尔基体在真核细胞蛋白分泌、分选和运输中起中心作用。GRASPs蛋白在高尔基体扁平囊堆叠中起着关键作用。目前尚不清楚GRASPs是如何介导扁平囊堆叠形成高尔基体的。我们初步研究发现了一种新颖的相互作用可以改变GRASP55蛋白结构，可能与GRASPs蛋白在高尔基体囊膜堆叠中调节变化相关。本项目申请拟在此基础上通过突变潜在的作用位点进一步研究多肽与GRASP55 PDZ结构域的相互作用，此相互作用位点与之前报道的GM130在GRASP65 PDZ结构域上的结合位点相似。我们也计划解析GRASP65与GM130衍生多肽复合物以及GRASP55与新发现的golgin45的复合物结构。比较这些复合物结构及其分子排列堆积方式、分析复合物结合底物前后的结构变化及其相互作用对分子排列的影响，结合免疫荧光及电镜等生物化学及细胞生物学技术深入揭示GRASPs蛋白在高尔基体囊膜堆叠中作用的结构基础和分子机理。

在哺乳动物细胞中GRASP65与GRASP55蛋白在高尔基体的扁平囊堆叠中起着关键作用。GRASP65与顺面高尔基体基质蛋白GM130相互作用，而GRASP55主要分布于中间囊膜，与Golgin45相互作用，具体它们是如何介导扁平囊堆叠的？目前还不清楚。我们通过结构生物学研究，解析了GRASP65与GM130 C端多肽复合物以及GRASP55与Golgin45 C端多肽复合物三维晶体结构，我们从复合物结构第一次发现GM130和 Golgin45同时与GRASP蛋白的PDZ1和PDZ2结构域相互作用，其末端以经典方式结合在PDZ1结构域的多肽结合区。二者又有所不同，GM130的结合可以引起GRASP65发生构象变化，而Golgin45的结合并不引起GRASP55发生构象变化；另外锌离子对GRASP55与Golgin45的结合不可或缺的。根据复合物结构我们提出了新的高尔基体顺面囊膜和中间囊膜的堆叠模型。它们虽然很相似，但有着不同的堆叠方式，这和它们单向运输蛋白的特性是一致的。另外，GRASPs分子在非经典分泌途径中起着不可缺少的功能，我们的合作者研究发现GRASP55与连接黏附分子JAMs有相互作用，它们在精子发育过程中发挥着重要的功能。我们实验验证了它们的相互作用并解析了GRASP55-JAM_B、GRASP55-JAM_C的复合物三维晶体结构。复合物的结构揭示JAM_B、JAM_C的C末端也以经典方式结合在PDZ1结构域的多肽结合区。基于复合物结构设计的小分子化合物Graspin可有效的抑制小鼠精子发育，可作为潜在的男用节育药开发使用。根据我们解析的结构推测通过非经典分泌途径的膜蛋白可能通过其C末端保守的valine motif与GM130和 Golgin45竞争GRASP分子上PDZ1的经典多肽结合位点而进入非经典分泌途径的。总之，通过本项目的研究，我们解析了4个复合物结构；发现了一种PDZ与其它蛋白新的结合方式；发现了锌离子及其在结合中的重要作用；发现GM130和 Golgin45同时与GRASP蛋白的PDZ1和PDZ2结构域相互作用，而且它们的相互作用非常不同；我们的发现理清了本领域之前的一些错误观念。我们不但提出新的高尔基体顺面囊膜和中间囊膜不同的堆叠模型，还提出了非经典分泌途径的可能机理。