靶向TRPA1通道的香豆素类镇痛活性成分结构优化及作用机制研究

Transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) is a novel analgesic target in new drug R&D. Inhibitors of TRPA1 has significant analgesic effect and little adverse effects, thus its research has become a popular field of new analgesic drugs nowadays. Our earlier work identified the coumarin-type small molecule, murpanicin from the medicinal plants of Murraya species. As a novo TRPA1 inhibitor, murpanicin exhibited good TRPA1 inhibitory activity in both in vitro and in vivo experiments and showed significant attenuation of pain evoked by formalin or AITC. Molecular docking showed that small molecule binds to Asn954 side chains of TRPA1 inner pore region by hydrophobic interaction, thus blocking TRPA1 channel. However, in comparison with other developed TRPA1 inhibitors, problems of low binding efficiency and weak selectivity to TRPA1 still exist for murpanicin. Therefore, in this proposal we aim to take murpanicin as a precursor for structural modification and mechanism study. With the aid of molecular docking, molecular biology, and electrophysiology techniques, we will design and synthesize murpanicin derivatives with higher selectivity and potency. We will also investigate the TRPA1 binding pocket of murpanicin and its derivatives and research on their TRPA1-related in vivo efficacy. This research will provide SAR explanation of TRPA1 inhibition. It will also provide novo coumarin-type small molecule inhibitors for TRPA1 ion channel with explicit binding mechanism and in vivo effect. It will also provide insight to the further design of TRP-inhibiting analgesic drugs.

瞬时受体电位锚定蛋白1 型离子通道（TRPA1）是新型镇痛药物的靶点，其抑制剂有着镇痛效果明显、副作用小等特点。本课题组前期从九里香属植物中分离出香豆素类化合物九里香丙素，为一种新型的TRPA1天然抑制剂，并在小鼠体内表现出良好的镇痛活性。分子模拟对接初步结果显示，九里香丙素通过与Asn954周围口袋结合，抑制TRPA1通道的开放。然而，相比其他TRPA1抑制剂，九里香丙素仍存在结合性较弱、选择性不强等问题，其与TRPA1的结合位点具有新颖性，值得深入研究。基于上述问题，本课题拟对九里香丙素类的香豆素进行结构优化、构效关系分析，设计与合成出结合效果更好、抑制活性更强的TRPA1选择性抑制剂，并进行体内镇痛药效及其结合口袋及位点的确认。通过研究，阐明香豆素类化合物抑制TRPA1通道的构效关系，发现药效明显、选择性强、作用机制清晰的靶向TRPA1通道蛋白的抑制剂，为镇痛药物的研发奠定基础。

离子通道抑制剂的发现是科学研究的难题。在研究植物九里香成分九里香丙素对于TRPA1镇痛离子通道的抑制作用的同时，我们意外的发现，九里香丙素手性单体B304-2对于TRPV2通道起到显著的抑制作用，抑制活性IC50在3.7 μM。TRPV2在人体免疫调节系统、人体血管平滑肌细胞、某些相关癌症和肿瘤细胞系、小鼠前脂肪细胞分化过程中起到一定调节作用，在体内调控的药理作用尚未完全阐明，因此其相应的抑制剂的研发可提供重要的工具药和参考作用。本课题利用并改进了本课题组发现的基于荧光的微流控芯片方法，形成了测量和筛选TRPV2 离子通道活性的稳定荧光测试方式，并设计了TRP通道测试专属微流控芯片。该方式实验稳定性强于Flexstation方法、速度快于膜片钳测试、且易于操作。我们通过分子对接的方式发现了TRPV2和抑制剂分子的结合位点，并用点突变的方式对该位点加以验证。通过虚拟对接的手段，我们筛选了约10000个香豆素类小分子结构，得到了Screen2，Screen11等具有显著结构特征并在微流控芯片测试中具有明显活性和的香豆素类TRPV2抑制剂分子。同时，通过研发了TRPV2的抑制剂前体九里香丙素和L290的合成方法，通过优化前体分子，我们得到了系列产物，其中“573”系列分子具有新颖的香豆素类结构。我们发现，在系列衍生物当中，产物OEt-17，573-NF2在微流控芯片测试以及膜片钳测试中表现出很强的TRPV2抑制能力。基于TRPV2的活性研究发现，九里香丙素单体B304-1,、B304-2在小鼠前脂肪细胞内抑制TRPV2活性并逆转TRPV2激活剂2-APB促进的前脂肪细胞分化效果。同时，本课题对另一类新型抗炎香豆素分子Exotine A进行了合成与钓靶研究，发现其作用于布鲁顿酪氨酸激酶（BTK），后续的研究尚在进行中。本课题在TRPV2的筛选方法、抑制剂发现与香豆素类分子合成方面均有一定创新，为TRP离子通道的活性分子发现和功能研究提供了重要参考。