Dnah3和Tekt1在异源三倍体鲫精子细胞分化中的功能研究

Previously research indicated that round spermatids in allotriploid crucian carp did not form mature sperm that possess normal nuclei and integrated tails. In this project, we will pay attention to two key genes related with spermiogenesis, namely, Dnah3 and Tekt1, according to transcripts and miRNAs of mature testes in allotriploid crucian carp and diploid crucian carp. Studies on gene structures, expression and functions of these two genes will be carried out. By using quantitative real-time PCR, immunohistochemical staining, CRISPR/Cas9 knock-out technology, measure of sperm vitality and so on, we are planning to survey the functions of Dnah3 and Tekt1 in spermiogenesis of allotriploid crucian carp. Meanwhile, relationship between miR-199-5p and Dnah3 or Tekt1 will be tested by using the dual luciferase reporter assay system. This study will not only elucidate the key roles of the Dnah3 and Tekt1 genes during spermiogenesis in fish, but also promote studies on mechanism on sterility in allotriploid crucian carp at molecular level.

前期研究表明异源三倍体鲫的精子细胞不能形成成熟的正常精子。本项目在获得异源三倍体鲫及其对照鱼的成熟精巢转录本和miRNA数据基础上，将聚焦与精子形成相关的重要基因- Dnah3和Tekt1的结构、表达和功能研究，运用实时荧光定量PCR、免疫组化、CRISPR/Cas9基因编辑技术、精子活力测定、精子细胞分离及孵育等研究手段，系统研究Dnah3和Tekt1基因在异源三倍体鲫精子细胞分化（精子形成）过程中的功能；同时，拟运用双荧光素酶报告基因实验验证异源三倍体鲫表达上调的miR-199-5p与Dnah3和Tekt1基因的靶标关系。该研究不仅有助于阐明Dnah3和Tekt1在鱼类精子形成中的关键作用，还将在分子水平促进揭示异源三倍体鲫的不育机制研究。

精子异常是导致雄性不育的主要因素之一，但其发病机制尚不清楚。前期研究结果表明，异源三倍体鲫的雄性不育与精子细胞不能形成正常成熟精子有关，这为研究动物精子形成机制提供了非常有用的实验材料。Dnah3和Tekt1基因编码的蛋白在精子鞭毛形成或运动中具有重要作用。本项目克隆获得了不同倍性鲫鲤Dnah3和Tekt1基因cDNA全序列，其中红鲫和异源三倍体鲫Dnah3基因都编码含4017个氨基酸的Dnah3蛋白，鲤编码含4014个氨基酸的Dnah3蛋白；红鲫和异源三倍体鲫Tekt1基因都编码含402个氨基酸的Tekt1蛋白，鲤编码含405个氨基酸的Tekt1蛋白。通过qRT-PCR比较研究了Dnah3、Tekt1及miR-199-5p在不同倍性鲫鲤不同组织的分布情况，结果表明Dnah3和Tekt1主要存在于精巢，miR-199-5p在所检测的组织中广泛表达。通过qRT-PCR方法检测了Dnah3、Tekt1及miR-199-5p在不同倍性鲫鲤精巢中的表达差异，结果表明，在繁殖期，异源三倍体鲫Dnah3和Tekt1在精巢中的表达量低于二倍体红鲫，而在非繁殖期，异源三倍体鲫Dnah3和Tekt1在精巢中的表达量高于二倍体红鲫。miR-199-5p的表达趋势与Dnah3和Tekt1表达的趋势正好相反。Western blot分析表明，异源三倍体鲫的Tekt1蛋白在精巢中的表达量无论在非繁殖期还是在繁殖期均低于二倍体红鲫。免疫组化结果表明，Tekt1主要定位于精巢的精子细胞和精子，表明其可能与精子形成过程有关。双荧光素酶报告基因实验证实了miR-199-5p直接靶向Tekt1 3'-UTR。miR-199-5p功能获得可导致精子细胞凋亡和精子结构异常，这与异源三倍体鲫相似。本研究结果阐明了miR-199-5p和Tekt1在不同倍性鲫鲤精子形成中的关键作用，在分子水平进一步揭示了雄性异源三倍体鲫的不育机制。