肿瘤细胞耐受细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤功能的机制研究

Cancer immunotherapy is an emerging strategy, but resistance to the immunotherapy is a big problem to be urgently resolved. Our studies have demonstrated that at early tumor stage therapeutic vaccination could induce efficient anti-tumor activity by amplifying the CTL response, whereas at late tumor stage therapeutic vaccination is invalid due to tumor-induced cytolytic dysfunction of CD8+ T cells. In addition, the tumor cells become resistant to lysis by CD8+ T cells. This project will elucidate the mechanisms by which the CTLs lose their cytolytic functions and tumor cells are resistant to the lysis by T cells. Thus we will investigate: 1) whether persistent tumor antigen stimulation causes the dysfunction of tumor-specific CD8+ T cells; 2) whether the dysfunctional CD8+ T cells express T-bet and EOMES and whether the upstream signals are operational; 3) whether persistent antigen stimulation causes higher activation of NFAT-1 relative to AP-1, which lead to the loss of the cytolytic function; 4) whether tumor cells resisting CTL lysis express LMP2/7/10 and INF-γ R or less and whether INF-γ R signaling is operational. A thoroughly understanding of the mechanisms will help develop effective treatment regimes for tumors.

肿瘤免疫治疗是治疗肿瘤的一种新策略,但其耐受性是目前亟待解决的问题。我们的前期结果显示:在肿瘤早期阶段，治疗性疫苗能有效扩增具有抗肿瘤功能的细胞毒性T淋巴细胞(CTL),但在肿瘤晚期，由于肿瘤所致的CTL杀伤功能障碍，治疗性疫苗则无效。此外，肿瘤细胞也随之对CTL的杀伤功能产生耐受。本研究将揭示CTL在肿瘤晚期失去杀伤活性的机制以及在肿瘤生长过程中肿瘤细胞耐受CTL杀伤功能的机制。为此,我们将进行以下研究:(1)持续的肿瘤抗原刺激是否会导致CTL的功能障碍;(2)功能障碍的CTL是否表达T-bet/Eomes且上游信号是否通畅;(3) 持续抗原刺激是否引起NFAT-1比AP-1活性更高而导致CTL杀伤功能障碍;(4)在肿瘤生长过程中耐受CTL杀伤功能的肿瘤细胞是否低表达LMP2/7/10和IFN-γ受体，或IFN-γ受体信号传导是否减弱等。全面了解该机制将有助于制定有效的肿瘤免疫治疗方案。

肿瘤免疫治疗在临床上取得了重大突破，在肿瘤组织中，抗原特异性T细胞发挥了主要的抗肿瘤效应。但是由于肿瘤免疫抑制微环境的存在，抗原特异性T细胞在持续的肿瘤抗原刺激下发生耗竭，失去抗肿瘤功能，无法有效控制肿瘤进展。在本研究中，我们为更加真实反映抗原特异性T细胞在肿瘤微环境中的存在状态，构建抗原特异性T细胞体内耗竭模型。将B16-OVA细胞皮下注射至CD45.1小鼠一侧，待成瘤后静脉回输取自CD45.2 OT-I小鼠脾脏的CD8+ T细胞，观察肿瘤生长情况。分别取回输后Day3和Day7小鼠肿瘤组织、脾脏和外周血进行流式检测，结果表明Day7中OT-I PD-1+ CD8+ T细胞功能受到损害，提示其在Day7中发生耗竭，并采用多种肿瘤类型进行验证，得到一致结果。为探究其耗竭的内在机制，我们采用流式分选Day3和Day7小鼠肿瘤组织中PD-1+ CD8+ T细胞，进行转录组测序，利用生物信息学分析筛选关键调控分子。其中，代谢相关分子苹果酸酶1（Me1）在Day7明显下调。在体外实验中，我们敲低人和小鼠CD8+ T细胞中Me1分子，流式分析PD-1+ CD8+ T细胞功能变化，发现敲低Me1后PD-1+ CD8+ T细胞因子分泌水平降低。因此，我们进一步采用动物实验验证Me1对抗原特异性T细胞的作用。分别将敲低Me1后的OT-I CD8+ T细胞（shMe1组）及对照组OT-I CD8+ T细胞（shNC组）回输至LLC-OVA荷瘤小鼠体内，测量肿瘤体积大小。结果表明shMe1组小鼠肿瘤体积明显增大。同时，我们在临床肿瘤患者标本中也进行验证。收集临床肺癌患者外周血，分选PD-1+ CD8+ T细胞，采用trizol法提取总RNA，并反转录获得cDNA，再采用荧光定量PCR检测Me1表达与功能分子的相关性，结果显示肺癌患者PD-1+ CD8+ T细胞中Me1表达与功能分子表达呈正相关。本研究从代谢调控的角度阐明抗原特异性T细胞在持续肿瘤抗原刺激下发生耗竭的机制，代谢相关分子Me1下调引起T细胞耗竭，减弱其抗肿瘤功能，这说明Me1作为潜在的肿瘤治疗靶点有一定应用前景。研究Me1影响肿瘤微环境中抗原特异性T细胞功能的作用机制，对探索逆转T细胞耗竭及新的肿瘤免疫治疗策略有一定的理论和实践意义。