高通量微流控皮升液滴打印技术及其在数字PCR中的应用研究

Picoliter droplet is a perfect micro reactor in the high-throughput parallel quantitative biochemical analysis for its small volume and low reagent consumption. In this project, a new piezoelectric microfluidic impact printing technology is proposed to improve the controllability of the generated droplets, as well as to meet the demands of low-cost, multichannel and no cross-contamination. By combining the precision printing with microfluidic theory, the proposed microfluidic print system can be used to generate adjustable, addressable droplets for universe bio-applications. The structural model of the microfluidic chip is built for analysis of the stress, flow status during impact and formation of droplets. Piezoelectric actuators are used in the system to control the droplet volume for their high precision in stroke and high frequency in vibration. Also the interchangeable microfluidic chip is chosen avoiding cross-contamination. In this project, the microfluidic impact printing, along with technologies of droplet storage, mixing, reaction and measurement are researched to develop the digital PCR method for single cell genetic analysis. The successful implementation of this technology can demonstrate its potential in detection of single molecular at cellular level, which will promote the development of next-generation sequencing technology in our country.

皮升体积液滴作为一种微反应器，因为体积小、试剂用量少适合在其中进行海量的并行反应，在高通量、定量生化检测中有着重要的应用价值。针对目前皮升液滴产生技术在液滴成分与大小可控性的不足，以及其对低成本、多通道、无交叉污染的应用需求，本项目结合压电打印与微流控原理，提出研究基于压电驱动的微流控冲击打印技术，建立一种大小与成分可调、可寻址的并行液滴产生新方法。通过建立微流控液滴产生的力学模型，揭示高精度皮升液滴产生规律；利用压电打印头与微流控芯片“墨盒”分离的方法，实现微量试剂无交叉污染的打印；研究液滴体积可调的压电打印控制技术，解决多通道打印一致性问题；发展生物样品在液滴中的存储、融合、反应与检测技术，并在此基础上开展微流控打印在数字PCR中验证性研究。这一技术的研究有望在细胞层面实现单分子水平的基因检测，促进我国下一代基因分析技术的发展。

在生化反应及分析中，体积在皮升到纳升范围的微液滴作为一种新型的微反应器有着十分重要的应用前景。与传统反应容器相比，液滴式微反应器具有以下优点：首先是体积小，试剂的消耗少，还可以减少有害物质的使用与合成，降低了因剧烈反应而带来的危险性；其次，微小的反应体系也使反应物分子扩散距离减小，有助于反应物之间的混合，提高反应速度；第三个优点是区块化，每一个微液滴都可以独立的操控，确保各液滴之间为相互独立的反应单元；第四个是并行化，大规模单分散且高度一致的微液滴为分析实验提供了并行化反应平台，极大地提高了实验效率。目前皮升体积微液滴产生技术存在体积大小不可调，使用成本高，应用样本量受局限，并不适合生化检测技术。为此，本项目提出一种压电微流控冲击打印技术来产生体积在皮升到纳升范围的微液滴。. 我们针对以下核心内容展开研究：冲击作用下微管道内流体力学行为分析与皮升液滴产生机理；压电驱动微流控冲击打印技术研究与多通道压电生物打印系统的建立；微流控冲击打印技术应用于液滴数字 PCR 检测。通过分析微管道液体流动规律，我们成功建立了微流控打印液滴生成模型，发现了流阻比这一参数在微流控打印中的重要作用，揭示了微流控芯片设计在微流控打印中的关键作用。我们搭建了微流控打印平台，系统性研究了驱动电压、频率等参数，以及芯片的流阻比，喷口尺寸等参数对液滴产生的影响规律，能够稳定生成体积可控，多种成份，可寻址的微液滴阵列。在此平台上，我们研究了高通量液滴产生，核酸分子在微滴反应器中生物体系构建、温度扩增及其荧光探测等一系列难题，最终实现了基于微流控打印的数字PCR检测，比目前主流的荧光定量PCR检测的灵敏度提高2个数量级以上。微流控打印技术的成功实现，将目前主流生化反应体系由微升级推进了纳升甚至皮升级，为更高精度的生化分析提供技术基础。这一技术在生物检测上的可行性验证，进一步证明了其在下一代生化检测广阔前景。