蜡样芽孢杆菌MBL13-U高效降解牛骨胶原蛋白的基因定位、表达及降解机理的研究

Bio-degradation of bovine bone collagen by microbes was considered as one of efficient ways to utilize the bovine bone wastes. Up to now, there are few reports about the degradation mechanisms under the action of microbes. Based on this condition, in this project Bacillus cereus MBL13-U strain, which is screened for efficient degradation of bovine bone collagen, is going to be used to unveil its degradation mechanism through the follow procedures. First, the B. cereus MBL13-U collagenase with high enzyme activity will be purified by using such purification technologies as column chromatography, electrophoresis etc.. Meanwhile, the enzymatic properties and N-terminal amino acid sequence of the purified collagenase also will be determined. Then, the function genes of collagenase will be located, cloned and expressed by utilizing the genetic engineering techniques such as PCR and bioinformatics analysis etc. to obtain the new safe bacteria strains and functional gene sequences. On this basis, the structure of collagenase will be predicted and its function mechanism in degradation process will be revealed. Finally, Using spectroscopic methods, membrane separation, HPLC, electrophoresis and HPLC-MS etc., the bio-degradated products of bovine bone collagen will be analyzed, separated and identified to clarify pathways and molecular mechanism of bio-degradation. This project will provide an effective way to comprehensively utilize the bovine bone wastes with lower cost. Meanwhile, it also can lay a scientific foundation to identify the novel genes or strains for efficient degradation of bovine bone collagen.

微生物降解牛骨胶原蛋白被认为是未来有效利用牛骨废弃物的手段之一，然而对于其降解机理的研究目前国内外还鲜有报道。本项目以此为切入点，以选育的高效降解牛骨胶原蛋白的菌株Bacillus cereus MBL13-U为研究对象，对其降解机理进行阐释。首先采用柱层析、电泳等分离纯化技术对菌株所产高酶活的胶原蛋白酶进行纯化分离，并测定其酶学特性与N-末端氨基酸序列；然后利用PCR和生物信息学分析等基因工程技术对胶原蛋白酶的功能基因进行定位、克隆和表达，获得功能基因的序列和安全高效的降解菌株，同时预测酶的结构，揭示酶结构降解牛骨胶原蛋白的功能作用；最后利用光谱学、膜分离、HPLC、电泳和HPLC-MS等对降解产物进行分析、分离与鉴定，阐明胶原蛋白酶降解牛骨胶原蛋白的途径和分子机理。该项目将为解决牛骨废弃物的综合利用提供新的突破口，同时也可为扩展、寻找其他高效降解骨胶原蛋白的基因或菌株研究奠定科学基础。

微生物发酵降解牛骨胶原蛋白被认为是未来有效利用牛骨废弃物的手段之一，然而对于其降解机理的研究目前国内外还鲜有报道。本项目以此为切入点，以选育的高效降解牛骨胶原蛋白的菌株Bacillus cereus MBL13-U为研究对象，对其降解机理进行阐释。该项研究对于畜禽骨资源的综合利用和开发新型蛋白酶具有重要的意义。首先在优化菌株高产酶的工艺条件基础上，针对菌株所产胶原蛋白酶的分离纯化与性质研究。将破碎的菌株及其发酵液分别通过硫酸铵沉淀、DEAE-cellulose 52离子交换层析及Sephadex G-100凝胶过滤纯化得到分子量为48±2.0 kDa纯化酶BCC；酶学特性表明该酶为骨胶原蛋白酶，且对I型胶原蛋白水解能力显著优于其他类型胶原蛋白；酶的N-末端氨基酸序列为Met-Lys-Gly-Tyr-Ser-Lys-Lys-Val-Leu-Ile-Gly-Val-Ser-Phe-Ala。然后根据纯化酶的氨基酸序列和同源性分析设计引物，以B. cereus MBL13-U基因组DNA为模板，对基因组进行PCR扩增，获得胶原蛋白酶的基因全序列。以分子生物学开放软件包的Getorf对基因全序列进行分析，找出开放阅读框（ORF）及起始密码子和终止密码子，编码区编码全长的蛋白质，根据软件分析和同源性比较推测该蛋白质的功能构象。结合蜡样芽孢杆菌全基因组序列信息，确定了BCC酶的功能基因在基因组中的定位。将其与表达载体相连，获得重组质粒；转入到大肠杆菌细胞中诱导表达，验证基因表达效果，成功构建了高效降解牛骨胶原蛋白的工程菌pET30a-colM13U/BL21(DE3)。在上述研究获得的目的基因全序列的前提下，利用PHDsec和Swiss-Model等工具对胶原蛋白酶的二级结构和三维结构进行预测，初步分析了酶的结构对牛骨胶原蛋白的降解机理。最后针对纯化酶降解牛骨胶原蛋白的途径和分子机理进行研究。首先通过五元二次正交旋转试验确定了BCC酶解牛骨胶原蛋白的最佳工艺条件；针对通过采用UV、荧光光谱、DSC、红外（FT-IR）光谱等对胶原蛋白酶降解牛骨胶原蛋白的产物进行定性分析，然后利用扫描电镜（SEM）观察了和液质联用（HPLC-MS）技术分析了BCC在胶原蛋白肽链上的酶切位点，揭示胶原蛋白酶降解牛骨胶原蛋白的途径与分子机理，同时为未来有效的开发利用畜禽骨资源提供出全新思路与突破口。