联合转录因子、GLP-1、Gastrin在大鼠骨髓间充质干细胞转分化为胰岛样细胞中的作用机制

In recent years, insulin-producing cells substitution therapy is considered to be a promising treatment to cure diabetes. Our preliminary studies initially proved the effects and mechanisms of Pdx-1 on transdifferentiation of BMSCs into insulin-producing cells, but the ultrastructure and function of insulin-producing cells which we obtained are not ideal. In this study the optimized method suitable for induction and differentiation conditions of insulin-producing cells will be screen and investigated.In this project based on the previous studies, the three kinds of plasmids against different antibiotics, which can be directly applied to clinical practise, will be transfected into the target cells BMSCs. Subsequently, the following experimental studies will be carried out: 1)screening the transfected cell lines which can efficiently and stably express the Pdx-1, Ngn3 and MafA genes, and investigating the specific combined effects of the three transcription factors on the related gene expression, including the insulin gene. 2) establishing GLP-1 and gastrin induced insulin-secreting engineering cells, and exploring the molecular mechanisms of GLP-1 and gastrin induced proliferation of insulin-producing cells.3) the efficacy evaluation and immunohistochemical analysis of the rat renal capsule transplantation. This project will help us to establish consummate differentiation technology of insulin-producing cells and lay a foundation of clinical theory and practice.

近年来，胰岛样细胞替代疗法被认为是一种很有希望治愈糖尿病的途径。我们的前期工作初步探明Pdx-1基因在转分化BMSCs为胰岛样细胞中发挥重要作用，但所获胰岛样细胞的超微结构和功能尚不理想。如何优化胰岛样细胞的诱导分化条件并探明其中机制是亟待解决的难题。本项目将在前期研究工作的基础上，以BMSCs做为靶细胞，采用可后期直接应用于临床的三个抗不同抗生素的质粒，1）筛选能稳定高效表达Pdx-1, Ngn3 和MafA基因的转化细胞株，明确这三个转录因子的特定组合影响包括胰岛素在内的相关基因的表达情况； 2）建立在GLP-1 和gastrin的诱导下能有效分泌胰岛素的工程细胞株，探讨GLP-1和gastrin进一步促进胰岛样细胞增殖的分子机制；3）鼠肾被膜移植，疗效评定及免疫组织化学分析。本项目的研究成果将建立完善的胰岛样细胞分化技术，为临床推广奠定理论及实践基础，具有重要的临床应用价值及社会效益

项目背景：.研究发现，胰十二指肠同源盒1(Pdx-1)、神经元素3（Ngn3）和V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A（MafA）在胰腺内分泌细胞发育和β 细胞分化以及功能完善中起着极其重要的作用，这些转录因子能够诱导干细胞表达一些胰腺内分泌功能相关的基因，但没能转换成功能性β 细胞的表型或形态。有文献报道，一些胃肠激素在胰岛样细胞的增殖分化及功能维持方面发挥重要作用，如胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、胃泌素(gatrin)。本研究拟采用Pdx-1、Ngn3 和MafA 联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞，GLP-1和gastrin进一步诱导胰岛素分泌细胞功能的完善和表型的转化，并移植治疗糖尿病大鼠观察其疗效差异。.主要研究内容：.1、携带Pdx-1、Ngn3 和MafA腺病毒感染大鼠骨髓间充质细胞（BMSCs），western blot鉴定三基因是否成功转入BMSCs，ELISA法分析诱导细胞的胰岛分泌功能，RT-PCR检测诱导细胞胰岛素相关基因的表达情况，双硫腙染色鉴定诱导细胞的胰岛素分泌能力。.2、GLP-1 和gastrin 分别或联合干预胰岛样细胞，ELISA法分析诱导后细胞的胰岛分泌功能，RT-PCR检测诱导后细胞胰岛素相关基因的表达情况。探讨GLP-1 和gastrin 分别或联合干预对胰岛样细胞的影响和机制。.3、GLP-1 和gastrin 分别或联合干预后细胞分别移植到糖尿病大鼠肾被膜下，每周监测空腹血糖和体重变化，腹腔糖耐量实验监测糖负荷后大鼠血糖变化，胰腺免疫组化观察移植细胞的存活及分泌情况。.重要结果：.1、Pdx-1、Ngn3 和MafA成功诱导BMSCs分化为胰岛样细胞。.2、ELISA和RT-PCR法证实了GLP-1 和gastrin联合对胰岛样细胞的促增殖和促分化作用更为显著。.3、GLP-1 和gastrin联合诱导后的胰岛样细胞在体内存活及分泌胰岛素的水平最佳，移植后改善糖尿病大鼠的血糖及体重最为显著。.科学意义：.本研究成功的诱导BMSCs分化为胰岛样细胞，进一步探讨了GLP-1和gastrin对胰岛素分泌细胞的作用机制，为干细胞诱导分化为表型及功能更加完善的胰岛样细胞治疗糖尿病提供了新的思路。