葡萄泛素连接酶VvPUB44在果实成熟过程中的作用机制研究

Fruit ripening progress are accompanied by plant programmed cell death, the mechanism of ubiqutin ligase mediated programmed cell death in fruit ripening is unclear. To investigate the role of the ubiquitin ligase in fruit ripening, the expression analysis of U-box family of ubiquitin ligase was performed in prevous. The results showed VvPUB44 gene specific expression in grape flower and fruit, and exhibited high expression in fruit véraison. On this basis, this project intends to identify the VvPUB44 whether has the ubiquitin ligase activity, and abtain the VvPUB44 recognition substrate protein by yeast two hybrid, bimolecular fluorescence complementation and in vivo expression technology. Study the interaction model of VvPUB44 ubiquitin ligase and its substrate protein, and its role in the regulation of fruit ripening by transgenic experiment. These results not only definite the molecular biological function of VvPUB44 ubiquitin ligase, and provide new gene for grape transgenic research, and also reveal the ubiqutin ligase mediated programmed cell death in the regulation of fruit ripening, and provide the reference for the regulation technology of grape postharvest fruit ripening.

果实成熟过程伴随着植物细胞程序性死亡，泛素连接酶介导的程序性死亡在果实成熟中作用机制仍不清楚。为探讨泛素连接酶在果实成熟中的作用，前期对葡萄U-box家族泛素连接酶进行表达分析，发现VvPUB44在葡萄花和果实中特异表达，并且在果实转色期表达量急剧增加。本项目在此基础上拟鉴定VvPUB44是否具有泛素连接酶活性，并通过酵母双杂交、双分子荧光互补以及体内表达技术获得VvPUB44识别的底物蛋白；通过转基因试验来研究VvPUB44与其底物蛋白的相互作用模式，及其二者在果实成熟过程中的作用方式。这些结果不仅可以明确泛素连接酶基因VvPUB44的分子生物学功能，为葡萄转基因研究提供新基因，同时可以揭示泛素连接酶介导的程序性死亡在葡萄果实成熟的调控作用，为葡萄采后果实成熟调控技术提供参考。

果实成熟过程伴随着植物细胞程序性死亡，泛素连接酶介导的程序性死亡在果实成熟中作用机制仍不清楚。为探讨泛素连接酶在果实成熟中的作用，前期对葡萄U-box家族泛素连接酶进行表达分析，发现VvPUB44在葡萄花和果实中特异表达，并且在果实转色期表达量急剧增加。本项目主要研究内容包括鉴定VvPUB44是否具有泛素连接酶活性，并通过酵母双杂交、双分子荧光互补以及体内表达技术获得VvPUB44识别的底物蛋白；通过转基因试验来研究VvPUB44与其底物蛋白的相互作用模式，及其二者在果实成熟过程中的作用方式。本研究取得的主要研究结果包括：在葡萄果实中克隆了VvPUB44基因，该基因ORF长为2406 bp，编码801个氨基酸，具有U-box保守结构域。体外泛素化试验表明VvPUB44具有泛素连接酶活性。亚细胞定位试验结果显示VvPUB44定位在定位在细胞核、细胞质和细胞膜。为获得VvPUB44的互作蛋白，我们以VvPUB44为诱饵筛选酵母双杂交文库，结果获得26条候选序列，其中有4条序列编码同一个基因，该基因与拟南芥脱落酸醛氧化酶（ABA-aldehydeoxidase，AAO）高度同源，命名为VvAAO。酵母回复杂交试验结果表明VvPUB44与VvAAO在酵母体内能够发生相互作用；CoIP结果表明VvPUB44与VvAAO在体外能够发生相互作用。β-estradiol诱导VvPUB44表达可以抑制VvAAO的表达，蛋白酶体抑制剂MG132可以消除VvPUB44对VvAAO抑制表达。转基因草莓试验显示过量表达VvPUB44抑制了转基因果实的成熟，而VvAAO基因对草莓成熟没有影响。VvPUB44转基因草莓果实硬度、蔗糖含量显著大于对照；转基因草莓果实中花色苷含量显著低于对照。MG132处理后果实成熟关键基因CHS和DFR、PG1和PL、PS和SUT1的表达量显著高于未处理转基因果实。这些结果表明VvPUB44在葡萄中编码一个U-box类型的泛素连接酶，借助泛素化修饰来降解底物蛋白VvAAO基因，进而通过26S蛋白酶体信号转导途径来调控果实成熟。本研究初步揭示了葡萄泛素连接酶VvPUB44的分子生物学功能，不仅为研究葡萄果实成熟分子机制提供理论依据，还可以为葡萄生物技术育种提供候选基因资源。