C2HC型锌指结构蛋白调控水稻根系生长发育的分子机制研究

Crown and lateral root development sustain the growth during the whole plant life cycle in Oryza sativa L.. Therefore, it is particularly important to study the genetic regulation mechanism of crown and lateral root development in rice. As a dicotyledonous model plant, the root development research has been deep in Arabidopsis thaliana, and relevant basis regulation mechanism of which has certain instructive effect on the monocotyledons research in rice root development. However, there are many differences between monocotyledons and dicotyledonous in root genetic development and formation. It is necessary to do further research in rice root genetic development of molecular biology foundation. This project will apply reverse genetics to study the biological function of C2HC-type zinc finger protein initiation factor involved in regulation of growth and development of rice root in O. sativa L. cv. Aichi-asahi. Meanwhile, we also analyze the gene expression pattern and related signal transduction pathways. This study aims to exploit the biological function and regulated mechanism of novel initiation factor for controlling root development, expand the molecular biology foundation and understand the gene regulatory networks of root growth and formation. We hope that it can provide solid theoretical basis for molecular genetics breeding and high-yield cultivation in rice and other monocotyledons plants.

水稻冠根和侧根的生长发育维系着植株整个生育期。因此，对水稻根系生长发育的分子调控机制研究显得尤为重要。双子叶模式植物拟南芥的根系发育研究已比较深入，相关的分子调控机制对单子叶模式植物水稻根系的研究有一定的指导作用。但是，单子叶植物根系的遗传发育和形态建成与双子叶植物存在差异，因此，有必要深入拓展水稻根系遗传发育的分子生物学研究基础。本项目以水稻品种"爱知旭"为试验材料，主要从调控水稻根系发育的相关基因功能研究入手，利用反向遗传学方法研究水稻C2HC型锌指结构蛋白起始因子参与调控根系生长发育的生物学功能；分析该基因的表达模式和相关信号响应及转导途径。本研究旨在探索新的调控水稻根系生长发育的起始因子的功能和作用机制，拓展水稻根系生长发育和形态建成的分子生物学研究基础，明确水稻根系生长发育基因调控网络，为水稻等单子叶作物在分子遗传育种改良和高产栽培方面提供坚实的理论基础。

本研究前期工作利用酵母双杂交技术从水稻cDNA文库中筛选出一个与水稻侧根发育调控蛋白OsCYP2互作的CCHC型锌指结构蛋白（OsZFP），推测其可能参与调控水稻侧根的生长发育，在此研究基础上，完成了以下几个方面的研究工作：.1. 利用酵母一对一回复验证和体外GST pull-down进一步验证OsCYP2蛋白与OsZFP蛋白存在互作；.2. 构建了OsZFP基因干扰表达载体，通过水稻遗传转化获得了多个独立转化的株系；通过苗期侧根表型鉴定分析，发现干扰转化植株侧根数量显著少于野生型；.3. 对OsZFP基因进行亚细胞定位研究，证明该基因定位于细胞核；.4. 对OsCYP2基因和OsZFP基因各转化株系中IAA信号响应途径关键基因（OsIAA1、8、11、20、23、和31）进行定量表达分析。结果表明，两个基因的干扰株系对生长素均表现出不敏感；其中，OsIAA11基因在两个株系中都存在功能的冗余性；.5. 利用Crispr/Cas9技术对OsCYP2基因和OsZFP基因进行双敲除，已获得6个独立的双敲除突变体株系，其中两个株系收获少量T0代种子将用于后续研究；.6. 已完成OsZFP基因酵母双杂交表达载体构建，通过水稻cDNA文库筛选，鉴定到与OsZFP蛋白互作的4个候选靶蛋白（No.6：Os04g0402100，No.65：Os09g0361400，No.67：Os03g0219800，No.87：Os06g0687700），该结果将为下一步深入研究水稻侧根发育调控网络提供基础；.7. 对OsCYP2基因干扰转化植株与野生型植株进行RNA-Seq分析，获得3158个差异表达基因（1267个表达上调基因，1891个表达下调基因）；进一步分析获得11个侧根发育相关基因，且大部分为表达下调基因；同时，获得4个IAA信号响应途径关键基因，均为上调表达基因，上述差异表达基因RNA-Seq结果与qRT-PCR结果表现一致；差异表达基因KEGG富集pathway分析结果显示核糖体富集最显著。.目前，本项目受国家自然科学基金青年基金资助已发表SCI论文2篇（Frontiers in Plant Science，Journal of Integrative Plant Biology），中文核心期刊2篇，申请国内专利2项，顺利完成本项目研究计划。