自噬特异性SNARE蛋白调节胚胎干细胞多能性的作用和分子机制

Embryonic stem cells (ESCs) are capable of self-renewal and have the potential to differentiate into all cell types of adults, thus having broad application prospects in clinical practice. During in vitro culture, multiple pathways centered on the transcription factor network to precisely regulate the pluripotency of ESCs. Autophagy is a key pathway for the degradation of substances in eukaryotic cells, and is mediated by lysosomes. The homeostasis of autophagy is essential for the maintenance of pluripotency of ESCs. Previous studies have reported the role of key factors involved in autophagosome formation on the regulation of pluripotency, but the mechanism remains unclear. In addition, the SNARE proteins that mediate autophagosome and lysosome fusion, including Vamp8, Stx17, Snap29, have not been reported for the regulation of pluripotency and molecular mechanisms. We attempt to establish mouse ES cell lines with autophagic SNARE genes knockout, and detect the autophagy level, pluripotency regulatory network and developmental potential of the cells. Meanwhile, we will investigate the molecular mechanism of autophagy on pluripotency by detecting stability of pluripotent proteins, mitochondrial homeostasis and transcriptome analysis, to better reveal the conditions of pluripotency maintenance, and provide theoretical support for the application of stem cells in clinical practice.

胚胎干细胞能够自我更新，具有分化成为成体所有细胞类型的潜能，在临床上具有广阔的应用前景。在体外培养过程中，以转录因子网络为核心的多种途径精确调节胚胎干细胞的多能性。自噬是真核细胞内物质降解的关键通路，由溶酶体介导。自噬的稳态对于胚胎干细胞多能性的维持至关重要。之前的研究报道了自噬体形成阶段的关键因子，对于多能性的调节作用，但机制尚不清楚。此外，介导自噬体和溶酶体融合的SNARE蛋白，包括Vamp8、Stx17、Snap29，对于多能性的调节作用和分子机制，未有报道。本研究拟构建自噬特异性SNARE基因敲除的小鼠胚胎干细胞系，对细胞的自噬水平、多能性调控网络和发育潜能进行检测。同时，通过多能性蛋白稳定性、线粒体稳态检测和转录组分析等，我们将探究自噬调节多能性的分子机制，更好地揭示多能性维持的条件，为干细胞应用于临床提供理论支持。

胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESCs）能够自我更新，具有分化成为成体所有细胞类型的潜能，在临床上应用前景广阔。自噬是真核细胞内物质降解的关键通路，由溶酶体介导，自噬的稳态对于ESCs多能性的维持很重要。介导自噬体和溶酶体融合的SNARE蛋白对于多能性的调节作用和分子机制，未有报道。因此，本研究旨在探究关键的SNARE蛋白Snap29调节ESCs多能性的作用及机制。本研究首先使用CRISPR/Cas9技术，在小鼠ESCs中，稳定敲除了Snap29基因。Snap29缺失的细胞与野生型细胞相比，细胞增殖，碱性磷酸酶活性，Oct4、Nanog、Sox2等多能性因子的表达没有明显改变，这表明Snap29缺失不显著影响ESCs的自我更新能力。体外分化实验结果表明：Snap29敲除显著改变了ESCs的分化进程，显著增强了ESCs向心肌细胞的分化能力。转录组分析的结果进一步证实，Snap29缺失会提升ESCs向肌肉谱系细胞分化的能力，同时改变大量三胚层分化基因的表达水平。此外，Snap29敲除没有显著改变ESCs的自噬水平，而在Snap29敲除细胞中敲低SNAP家族蛋白Snap47，能够显著阻断自噬进程。综上，我们的研究揭示了自噬相关SNARE蛋白Snap29在ESCs自我更新维持、分化及自噬调控中的作用及机制，拓宽了对于多能性干细胞命运决定机理的认知，同时为相关疾病的研究提供了一定的理论支撑。