青藏高原糯青稞waxy基因研究

糯青稞（糯裸大麦）具有β- - 葡聚糖含量高、食用口感好、酿酒能耗低等优势，已受到广泛关注。Waxy基因突变是形成糯青稞的重要分子基础，我国对此研究晚，waxy基因突变的分子机制尚不清楚。本课题组已从大量青藏高原青稞中筛选到直链淀粉含量为3.2-15%的糯青稞资源，并对部分材料waxy基因结构和Wx蛋白进行了初步研究，显示我国糯青稞的waxy基因突变有很大差异。本项目针对这waxy突变差异，企图揭示是否存在独特的分子机制及是否有多个不同功能的waxy等位基因等问题，以基因结构-表达mRNA-表达产物差异为研究主线，结合分子生物学和生物化学的理论与技术，研究不同糯青稞的waxy基因结构及mRNA表达差异、胚乳发育不同时期Wx蛋白含量、酶活性以及不同突变体淀粉特性的差异，探索我国糯青稞waxy位点突变的分子机理，发掘不同功能的waxy新基因，为我国及世界糯大麦的选育提供材料和理论基础。

直链淀粉合成主要由Waxy基因所控制。对34份青稞的Waxy基因全长序列进行了克隆，对其DNA序列的多态性、RNA转录、GBSSI表达差异进行及淀粉特性进行研究。共发现了116个DNA序列的多态位点，可将供试材料分为Waxy I和Waxy II两类，11个单倍型。编码区共发现32个多态位点，其中5个单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）对Waxy基因的表达、直链淀粉的含量及淀粉特性具有重要作用。无直链淀粉的糯青稞Z999的第10外显子上的碱基G3935突变为T，但表现出较高的RNA转录水平和蛋白水平。无直链淀粉的材料Z1191中的第5外显子上的碱基C2453突变为T，导致多肽链中终止子提前，从而RNA转录和蛋白表达水平急剧下降。另三个SNP全都位于材料Z1337的第7外显子中，其表达水平及其他淀粉特性无特殊差异，但淀粉的崩解值极低。非编码区共发现了84个多态位点。其中在材料Z1979的5’非编码区中发现了一段403 bp的缺失，该缺失片段与低表达水平和低直链淀粉含量有关。此外，Waxy I类型中位于内含子1和外显子2中的一段191bp和15bp的插入，可能与高转录水平紧密相关，并且Waxy I类型与Waxy II类型相比较表现出独特的淀粉特性。总之，本研究揭示了在研究材料中存在三种主要的Waxy基因影响淀粉特性的分子机制：（1）Waxy基因中大片段缺失（5’UTR区约400bp的缺失、内含子1中约190bp的缺失）使该基因的表达下调，降低直链淀粉的含量，继而影响淀粉的功能；（2）Waxy基因中外显子关键SNP位点突变（C2453 – to – T或G3935– to – T）使该基因不表达或表达产物失活，从而形成无直链淀粉的糯青稞；（3）Waxy基因中外显子关键SNP位点突变不影响基因的表达和直链淀粉的合成，可能影响支链淀粉的结构从而改变淀粉特性。针对G3935– to – T SNP突变位点，开发了经济高效分子标记。结果表明Waxy基因多态性对青稞直链淀粉的合成和淀粉特性的差异具有重要影响，为各种具有不同淀粉特性的青稞材料的选育和加工提供了理论指导、材料基础和技术支撑。