利用分子生物学方法研究橡胶树死皮病发生分子机制

本项目拟采用抑制消减杂交技术鉴定橡胶树死皮病相关基因，同时收集其它已知橡胶树死皮病相关基因。根据上述死皮病相关基因序列设计Oligo探针并制备死皮病芯片，利用此芯片大规模筛选橡胶树死皮病相关基因。通过对橡胶树死皮病相关基因芯片杂交数据的系统分析，得出死皮相关基因的表达信息及聚类分析结果、功能分类、参与的pathway、各功能分类和pathway中基因的富集度、基因间及各pathway间的关联度。依上述信息确定橡胶树死皮病发生关键基因，采用转基因技术研究其生物学功能。根据死皮关键基因生物学功能、参与pathway、与其它死皮病相关基因及各pathway间关联度，从转录组水平阐明死皮病发生分子机制，为防治橡胶树死皮提供新思路和理论依据。

项目除按任务书计划完成外，还增加死皮及健康橡胶树树皮芯片杂交分析、死皮和健康橡胶树树皮转录组深度测序和死皮相关基因内含子长度多态性（ILP）标记开发等工作。项目发表文章13篇，其中SCI收录文章5篇，国内核心期刊5篇，国际会议论文3篇。申请国家发明专利3项，1项已获授权。. 主要成果概述如下：通过SSH和芯片技术鉴定橡胶树死皮相关基因300多个，在国际上首次发现逆境相关和代谢和能量相关基因分别在死皮和健康橡胶树中大量上调表达，并首次提出活性氧产生和清除、DNA甲基化、泛素蛋白体降解、细胞程序化死亡和橡胶生物合成途径为橡胶树死皮发生关键调控途径，在死皮发生中发挥重要作用。应用双向凝胶电泳技术(2-DE)比较死皮和健康橡胶树橡胶粒子膜蛋白表达差异，共鉴定出13个蛋白差异表达点，与健康株相比，在死皮中上调表达的蛋白质点有11个，下调表达的蛋白质点有2个，这些差异表达的蛋白质可能在橡胶树死皮发生和发展过程中发挥重要作用。对死皮相关基因HbTCTP、HbRad6、HbADF、Profilin和HbγGCS等进行了深入研究，证明HbTCTP和HbRad6分别具有抗氧化和DNA损伤修复功能。. 开展了死皮和健康橡胶树树皮转录组深度测序工作，为深入研究橡胶树死皮发生机制奠定了基础。完成健康橡胶树树皮转录组深度测序数据组装及EST-SSR标记开发工作，获得22756个unigenes，对基因进行了注释及GO、KEGG和COG分类研究。在22756个unigenes中共预测到39257个EST-SSR标记位点，对EST-SSR标记特性进行了系统分析，随机挑选110个EST-SSR位点设计引物在橡胶树中进行验证。. 以蓖麻为参照基因组，比较了三种开发死皮相关基因分子标记方法的效率，与不参照基因组信息和不跨越内含子标记相比，ILP标记在PCR成功率、多态性频率和总多态性效率方面明显优于前两种方法，为大规模开发死皮基因相关分子标记奠定了理论基础。已完成102个死皮相关分子标记开发工作，并在39个橡胶材料中进行了验证，完成了39个橡胶材料多态性指数及标记种属见转换研究。该研究为橡胶树内含子预测、ILP标记开发及ILP标记种属见转换提供了理论基础。. 以上工作为从转录组水平深入揭示死皮发生机制、抗死皮品种（系）分子标记辅助选择育种和抗、感死皮品种（系）奠定