肝细胞CD36缺失影响MCP-1基因表达致NASH发生的分子机制研究

Cluster of differentiation 36(CD36) is involved in the development of non-alcoholic steato-hepatitis(NASH), because of its dual role in fatty acid transporter and scavenger receptor. CD36 deficiency promotes the development of NASH, but the mechanism is still unknown. We have found in the preliminary work that increased macrophage infiltration and MCP-1 gene expression were closely related to the NASH induced by CD36 deficiency. So we dedicate that hepatic CD36 deficiency up-regulates MCP-1 gene expression via down-regulating the ROS production and HDACs activity, which promotes hepatic macrophage infiltration and the development of NASH. We design experiments in vivo and vitro to investigate the impact of CD36 deficiency/ROS level/HDACs activity on the gene transcription of MCP-1; explore the relationship among CD36 deficiency, ROS and HDACs; check if supplement of ROS or forced over-expression of HDACs would alleviate the up-regulation of MCP-1 and macrophage infiltration in CD36 deficiency induced NASH. This research aims at the molecular mechanism of CD36 deficiency induced NASH, completes the important role of CD36 in physical function of hepatocellular, and provides reliable theoretical basis for the prevention and treatment of NASH in CD36 deficient patients.

白细胞分类抗原36（CD36）具有转运脂肪酸和介导炎症信号通路的“双重作用”，在非酒精性脂肪型肝炎（NASH）的发生发展中发挥了重要作用。CD36缺失能明显促进NASH的发生，但具体机制并不清楚。我们前期工作发现CD36缺失导致NASH与肝脏巨噬细胞浸润以及趋化因子MCP-1基因表达增加密切相关。研究证实MCP-1基因表达受到去乙酰化物酶（HDACs）调控，后者与细胞内ROS含量密切相关。我们推测：肝细胞CD36缺失通过抑制ROS产量和HDACs活性，上调MCP-1基因表达，最终促进肝脏巨噬细胞浸润和NASH的发生。我们拟通过体内外实验观察肝细胞CD36表达、ROS含量以及HDACs活性变化对MCP-1启动子区域组蛋白乙酰化以及启动子活性的影响，探讨CD36缺失导致NASH发生的具体分子机制，为CD36抗原缺失患者NASH的防治策略提供理论依据。

研究背景：非酒精性脂肪性肝病NAFLD已成为我国的常见病和高发病。非酒精性脂肪性肝炎NASH是NAFLD转向肝硬化、肝癌等恶性结局的病理基础。人白细胞分化抗原36（CD36），作为重要的脂肪酸转运体介导脂肪酸的转运；同时它又可以激活细胞内多种炎症信号通路，参与炎症的发生。多种病理条件促进肝脏CD36异常高表达，并与NASH病变程度正相关。但在CD36抗原缺乏人群和CD36基因敲除小鼠模型，CD36缺失同样促进NASH发生。本研究探讨了CD36缺失促进肝脏炎症和NASH发生的具体分子机制，为CD36抗原缺失人群NASH的防治工作提供重要的理论依据。.主要内容：我们利用RNAi技术下调HepG2细胞和THP-1细胞CD36表达，建立CD36缺乏的细胞模型；分离野生型C57BL/6J（widetype，WT）小鼠和CD36基因敲除(CD36-/-)小鼠的原代肝细胞和肝固有巨噬细胞（Kupffer），建立CD36缺失的细胞模型。同时利用WT小鼠CD36-/-小鼠模型，在体内外实验中观察这些模型在不同条件下的脂质蓄积情况、炎症因子表达情况、纤维化程度，并利用Transwell小室共培养系统了解在不同条件下巨噬细胞与肝细胞的相互作用。.重要结果：CD36-/-小鼠肝脏气球样变性和炎性细胞浸润，纤维化程度，脂质蓄积程度明显多于WT小鼠。但在单培养的细胞模型上CD36表达减少能明显降低炎症因子表达。在HepG2细胞和THP-1细胞共培养系统中，HepG2中进行CD36 RNAi 明显增加巨噬细胞迁移以及上清中炎症因子的含量。给予小鼠氯化钆注射后， CD36-/-小鼠肝脏炎症因子的基因表达低于WT小鼠。氯化钆注射后CD36-/-小鼠肝脏MIP-1、MIP-2表达低于WT小鼠，但MCP-1表达仍高于WT小鼠。在HepG2细胞中，CD36 RNAi 增加MCP-1表达，同时增加MCP-1启动子区域的H3乙酰化，但THP-1细胞中CD36 RNAi不改变MCP-1启动子区域的H3乙酰化。TSA处理或HDAC2 RNAi能上调HepG2细胞中MCP-1基因表达，对THP-1细胞中MCP-1基因表达没有影响。CD36缺失减少肝组织和肝细胞内H2O2和ROS水平。补充H2O2可以恢复CD36 RNAi HepG2细胞中HDAC2表达、降低MCP-1启动子区域H3乙酰化水平、减少MCP-1基因表达