17-β雌二醇调控绵羊输卵管上皮细胞β-防御素基因表达过程中NF-κB信号通路的研究

Reproductive tract β-defensins, which are important component for animal innate mucosal immune, has been more concerned because of its broad-spectrum antimicrobial and immunomodulatory functions. β-defensin gene expression is affected by many factors regulation, our study confirmed that estrogen could promote the expression of defensin in reproductive tract epithelial cell, and this function should via nuclear-receptor pathway and membrane-receptor pathway completed. However, a detailed study of the mechanisms has not been reported. In our study, we will investigate the NF-κB pathway in E2 up-regulatesβ-defensin 1 expression on ovine oviduct epithelial cells using cell culture, molecular biology, cell chemistry and chromatin immunoprecipitation technology. Meanwhile, we will investigate the phosphorylation and variation of GPR30, PI3K, IKK and p65 protein in NF-κB signaling pathway and clarify the mechanism of NF-κB signaling pathway activation. All of these will provide a theoretical basis for the regulation mechanism of defensin expression by estrogen or other regulatory factors, and these results also have important significance for the research and development of new features to estrogen （regulating mucosal immunity）.

生殖道β防御素(defensin)是动物先天黏膜免疫的重要组份，其广谱抗菌、免疫调节功能越来越得到关注。β防御素的基因表达受到许多因素调控，我们的研究证实，雌激素能够促进生殖道上皮细胞防御素的表达，这种促进是通过核受体途径、膜受体途径共同完成的。但详细的机制研究未见报道。本项目采用细胞培养、分子生物学、细胞化学与染色质免疫共沉淀技术，对雌激素调节绵羊输卵管上皮细胞β-防御素1基因表达过程中NF-κB信号通路进行研究。研究NF-κB信号通路中GPR30、PI3K、IKK 、p65蛋白的变化规律、磷酸化状态，阐明NF-κB信号通路激活的机制。为雌激素或其他调节因子对防御素表达的调控机理研究提供理论依据，对雌激素新的功能（调节黏膜免疫）的研发具有重要意义。

通过向绵羊输卵管上皮细胞添加17-β雌二醇诱导SBD-1的表达，利用RT-qPCR，Western blot，芯片，免疫组化，转录组测序等技术手段，研究在这一过程中以NF- κB为中心的雌激素通路中相关基因的调控作用结果表明：17-β雌二醇诱导输卵管上皮细胞中SBD-1的表达在前期需要通过GPR30所介导非基因组途径，且需要PKA，PKC和NF-κB信号通路三条信号通路的共同参与，而在后期需要雌激素受体所介导的基因组途径.NF-κB信号通路在17-β雌二醇诱导绵羊输卵管上皮细胞SBD-1基因表达中的作用机制：静息状态下的NF-κB同抑制蛋白家族的IκB相结合形成无活性复合体游存于细胞胞浆内，加入的17-β雌二醇作为外界刺激因子同GPR30结合并产生一系列的级联反应; 0.5 h后IκB蛋白发生磷酸化生成p-IκB蛋白，随后p-IκB蛋白通过泛素化被降解，游离的NF-κB蛋白被转运至细胞核内，1 h后转运核的NF-κB蛋白同SBD1启动子结合并激活SBD1的转录;随着细胞质内I-κB蛋白的降低，细胞内新生成I-κB并在外源17-β雌二醇继续刺激下发生磷酸化，但由于高表达SBD1的细胞毒性，细胞通过负反馈调节终止NF-κB信号通路，进而通过细胞内部磷酸化，脱磷酸化和泛素化使细胞内蛋白回归稳态。细胞通过蛋白磷酸化，泛素化，p65的蛋白核转运和负反馈调节共同维持17-β雌二醇对SBD-1表达的调控。结合转录组测序结果，发现之前未关注到的调控基因，将进行进一步的研究。