微纳尺度磷酸钙介导p53基因的抑癌效果及其与材料特征的关联效应研究

Safety and efficacy of gene therapy vector are the key factors in the success of gene therapy. To address the security problems of viral gene therapy vectors, non-viral gene therapy vectors, expecially for calcium phosphate, received more and more attention. In this study, micro- and nano- particles of calcium phosphate with different material characteristics will be specially designed as the gene therapy vector, in order to transfect p53 gene into cancer cells and tumor tissue. Through in vitro and in vivo biological evaluation, we systematically investigate transfection mechanism of calcium phosphate delivering the p53 gene and correlation effects between the characteristics of materials, like size, shape, crystalline phase, crystallinity and surface charge, with tumor suppressor effect. Herein, we not only research the safety of calcium phosphate as the cancer gene therapy vector and the efficacy of calcium phosphate transfect p53 gene into cancer cells to suppress cell proliferation and stimulate apoptosis, but also clarify the antitumor mechanism of calcium phosphate-p53 complex. This study will provide useful information that the new delivery system of gene for cancer gene therapy and strategies to search interaction among gene, vector and cell.

基因治疗载体的安全性和有效性是基因治疗成败的关键。为解决现有病毒类基因治疗载体的安全性缺陷，基于磷酸钙无机材料的非病毒基因治疗载体正日益受到关注。本项目拟设计、合成具有不同材料特征的微纳尺度磷酸钙（含HAp），将其用作基因治疗载体介导抑癌基因p53转染癌细胞与肿瘤组织。结合体外细胞实验与动物实验，系统研究分析材料粒度、形貌（粗糙度、长径比）、晶相、结晶度、表面电荷等材料学特性与p53基因抑癌效果之间的关联效应。探究磷酸钙用作肿瘤基因治疗载体的安全性，以及介导p53基因杀死肿瘤细胞或组织的有效性，进而阐明磷酸钙介导目的基因的抑癌机制。本项目研究不仅为新型基因载体携载抑癌基因的可行性提供科学依据，同时在探索无机载体介导抑癌基因的有效机制、基因-载体-细胞互作等方面具有重要的理论意义。

为解决现有病毒类基因治疗载体的安全性缺陷，基于磷酸钙无机材料的非病毒基因治疗载体正日益受到关注。本项目设计合成了具有不同材料特征的微纳尺度磷酸钙（含HAp），将其用作基因p53基因、lefty-1、siRNA与药物载体，用以转染细胞与肿瘤组织。.这些微纳尺度磷酸钙包括形貌迥异的中空球状、针状、棒状等磷酸钙纳米颗粒，它的平均粒径在1-3μm、300nm、200 nm、100 nm、50 nm 和 40 nm。经过不同的表面处理后，这些纳米颗粒被用来携载可用于杀伤恶性肿瘤的p53基因、lefty-1基因、siRNA、化疗药物如阿霉素（Dox）以及同时携载抑癌基因或化疗药物。本项目系统的对比研究了材料粒度、形貌、晶相、表面电荷等理化特性与肿瘤抑制效应的关系。经 PEI 修饰后的 HAp（HAp-PEI）呈正电性，其转染效率提高可提高13-14 倍。.装载药物的纳米颗粒可对肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌细胞产生显著的杀伤作用，动物实验研究结果证实了载药纳米颗粒可以实现对肿瘤组织的有显著抑制作用，通过解析材料特性与抑癌效果的关联效应研究，阐明了载药纳米尺度HAp的抑癌机制。中空 HAp 微球载药包封率大于 80%，在不同 pH 值的药物释放体系中释药时间长达 96 h，释药速率和累积释药量随 pH 值降低而增加，释药过程具有 pH 响应性。用纳米颗粒同时携载p53基因和阿霉素时，对肿瘤组织有显著的协同杀伤作用。.本项目还系统研究了纳米 HAp 携载药物后的体内的分布、降解、肿瘤靶向性。粒径分布在 40-200nm 范围时不同形状的纳米羟基磷灰石经静脉注射进入体内后，主要分布在肝脏中。粒径为 100 nm 的球形羟基磷灰石能够靶向肿瘤组织。S-HAp 经小鼠尾静脉注射进入体内后，降解过程具有明显时间依赖性，三周后其降解量能达 90%左右。研究证实了纳米 HAp 经小鼠尾静脉注射的安全性，体内良好的生物相容性以及可降解性，本课题为纳米 HAp 用于药物、基因载体的研究提供了实验依据，同时为无机纳米颗粒体内分布、降解等代谢过程研究提供了新方法。