鱼类淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定及其分子特性

课题组在前一个基金项目（30271016）中已经研制出抗淋巴囊肿病毒(LCDV)的单克隆抗体，建立了LCDV的牙鲆鳃细胞培养技术，定位了LCDV主要靶器官，从主要靶器官组织蛋白中分离得到3种能与LCDV特异性结合的蛋白。本项目拟在此基础上，应用病毒铺覆蛋白印迹技术（VOPBA）及免疫共沉淀技术，鉴定主要敏感细胞系/靶器官上的LCDV受体蛋白并分析其特性；纯化受体蛋白，测定其氨基酸序列，确定基因序列，获得其编码基因的体外表达蛋白并分析其特性；制备受体蛋白单抗，确定受体蛋白的组织定位与分布及受体抗体阻断LCDV感染的效果；通过在LCDV非允许细胞系上的受体重建及受体重建后的病毒感染实验，确定LCDV受体分子的功能特征及在LCDV感染中的作用。为了解LCDV感染的分子基础及寻找阻断病毒入侵的分子途径积累资料。

淋巴囊肿病毒（LCDV）是鱼类淋巴囊肿病的病原，已对鱼类养殖业造成巨大经济损失。本项目利用抗淋巴囊肿病毒（LCDV）单克隆抗体（单抗）及免疫共沉淀和病毒铺覆蛋白印迹技术，在牙鲆鳃细胞系（FG）和LCDV主要靶器官上鉴定出2种主要受体蛋白，其中27.8kDa蛋白为非糖蛋白，与β-actin蛋白有较强的相关性；37.6kDa蛋白为糖蛋白，与来源于家兔的GRIP和GCC2蛋白最为接近。研制了抗27.8kDa受体蛋白单抗；单抗2G11和3D9均可与FG细胞膜上的27.8 kDa蛋白特异性结合，且能够部分阻断LCDV与FG细胞膜蛋白的结合，阻断率分别为84.6% 和83.6%，二者混和液的阻断率为88.4%，阻断效果随抗体量增加而提高；2株单抗皆可显著阻断LCDV对FG细胞的感染。27.8kDa受体在牙鲆外周血白细胞、鳃上皮、表皮、胃黏膜上皮、肠上皮、肝、脾表层结缔组织及头肾后端的肾小管上皮内均有分布，而在大菱鲆和花鲈的受检组织中均能检测到阳性信号，但27.8kDa丰度随组织类型和鱼种不同而有差异。牙鲆外周血白细胞中27.8kDa受体蛋白阳性细胞主要为淋巴细胞，占白细胞数量的14.28%，表明白细胞可能在LCDV在鱼体内组织间传播中起重要作用。制备37.6kDa受体蛋白的兔抗血清，间接免疫荧光表明37.6kDa蛋白位于FG细胞表面；用胰蛋白酶和高碘酸钠处理可以阻断37.6kDa蛋白与LCDV的结合，说明37.6kDa糖蛋白的糖链参与结合LCDV；37.6kDa蛋白多抗能够延迟LCDV感染FG细胞后CPE的出现，抑制LCDV与37.6kDa蛋白的结合，抑制效果与多抗浓度存在剂量依赖效应。LCDV感染后FG细胞中27.8kDa受体蛋白浓度及病毒载量都较HINAE高。另外，发现一个与27.8kDa受体蛋白互作的LCDV黏附蛋白，分子量约为32kDa，由LCDV-C基因组中ORF038所编码；制备ORF038重组蛋白的兔抗血清，发现32kDa蛋白定位在LCDV粒子的囊膜上，与FG细胞具有结合活性；该多抗能有效阻断LCDV对FG的感染。以上研究成果表明27.8kDa和37.6kDa蛋白为介导LCDV进入细胞的功能受体，LCDV的32kDa黏附蛋白为27.8kDa受体的互作蛋白，为了解LCDV感染宿主的分子机制，寻找阻断LCDV感染的有效途径奠定了基础，具有重要的科学意义。