靶向介入栓塞后残存肝癌细胞的纳米基因载体的构建与转染研究

Currently, interventional therapy based on embolization is the major treatment for non-resectable hepatocellular carcinoma, but which could not treat tumor thoroughly. The survival cancer cells adapted to the microenvironment characterized by chronic hypoxia followed by acute hypoxia, and proned to relapse and metastasis.The purpose of this study is to screen hypoxia liver cancer cells in vitro by phage display peptide library, and then to screen survival cancer cells after interventional treatment in vivo used the phage peptide library screened in vitro, to obtain a high-affinity peptide which could combined to survival cancer cells after interventional embolization. After identify the combined ability to hypoxia liver cancer cells and isolated liver cancer tissue after interventional embolization,we synthesize the peptide to cationic Bletilla Striata polysaccharide, to construct a nanoparticle gene delivery carrier targeted to survival liver cancer cells after interventional embolization. Dynamic light scattering and electron microscopy are used to study shape, particle diameter, and Zeta-potential of the nanoparticle. Furthermore, we research its transfection effect to hypoxia cancer cells in vitro and to survival cancer cells after interventional embolization in vivo, to lay foundation for targeted gene therapy in survival liver cancer after interventional embolization.

以栓塞为基础的介入治疗是目前不可切除肝癌的主要干预手段，但栓塞术治疗肿瘤不并彻底，残存的肝癌细胞在以慢性缺氧及栓塞后急性缺氧甚至无氧为重要特征的微环境中，产生一系列分子水平的适应性变化，导致肿瘤难治并更易复发和转移。本课题拟采用噬菌体展示肽库技术，对缺氧肝癌细胞进行初步的体外差减筛选，用筛选出的阳性噬菌体对介入栓塞后的肝癌模型进行进一步的体内筛选，以筛选一种能与介入栓塞后残存肝癌细胞特异性结合的短肽，鉴定短肽与体外培养的缺氧肝癌细胞及介入栓塞后残存肝癌组织的结合能力。再以这种短肽为配体，修饰我们前期研究中所制备的阳离子型白芨多糖，构建一种对介入栓塞后残存肝癌细胞具有靶向转染作用的纳米基因递送载体，并采用动态光散射仪及电镜研究其形态、粒径、Zeta电位等。进一步研究纳米粒在体外对缺氧肝癌细胞，以及体内对介入栓塞后的残存肝癌细胞的转染作用，为介入栓塞后残存肝癌的靶向性基因治疗奠定基础。

背景：介入栓塞后的残存肝癌细胞存在于以缺氧甚至无氧为特征的肿瘤微环境中，其生物学行为不同于常氧肝癌细胞，在肿瘤的复发转移中发挥重要作用，也是治疗的难点。.主要研究内容：1）采用噬菌体展示肽库技术，以噬菌体7肽库对缺氧肝癌细胞HepG2进行3轮体外差减筛选，筛选产物再对裸鼠缺氧肝癌模型进行3轮体内筛选；2）筛选产物采用ELISA、细胞免疫荧光、组织免疫荧光法进行鉴定，获得阳性噬菌体克隆；测序获得阳性克隆的外源插入片段序列，选取重复率最高的阳性克隆，按照序列合成7肽（T7）；鉴定该肽与缺氧肝癌细胞及肝癌组织特异性结合能力；3）按不同比例合成PAMAM-PEG-T7，检测其毒性，制备不同比例的PAMAM-PEG-T7/DNA纳米粒，荧光显微镜与共聚焦荧光显微镜研究缺氧肝癌细胞HepG2对纳米粒的摄取及其在细胞内的分布；4）流式细胞仪检测不同比例的PAMAM-PEG-T7/DNA对不同细胞的转染效率；将体外对缺氧肝癌细胞HepG2转染效率最高的PAMAM-PEG-T7/DNA注入裸鼠缺氧肝癌模型体内，体内成像系统及荧光显微镜研究绿色荧光蛋白在体内的表达与分布。.重要结果与关键数据：1）鉴定及测序结果表明七肽GSTSFSK（T7）在筛选后的噬菌体中出现频率最高，且对缺氧肝癌细胞/组织结合能力最强；2）以不同比例合成PAMAM-PEG-T7（PAMAM:PEG=1:4，PAMAM:T7=1:1、1:2、1:3、1:4），修饰后的PAMAM细胞毒性明显降低；PAMAM-PEG-T7可以载质粒DNA进入缺氧肝癌细胞HepG2内，并保护DNA免受细胞内酶的降解，缺氧HepG2细胞对复合物的摄取可以被Lactoferrin等阻断；3）流式细胞检测结果表明不同比例的树状大分子以PAMAM:T7（mol/mol）=1:3、PAMAM:DNA（w/w）=5:1者对缺氧肝癌细胞HepG2的转染效率最高，达（30.23±3.32）%，体内转染研究表明PAMAM-PEG-T7/pDNA可以特异性结合于缺氧肝癌细胞并表达。.科学意义：本研究获得的7肽GSTSFSK修饰药物载体树状大分子PAMAM后，后者的细胞毒性明显下降，能特异性结合缺氧肝癌细胞，并进入细胞内，实现所携载基因的有效表达。经该7肽修饰的PAMAM具有潜在的耦联药物及分子探针的能力，有望在介入栓塞后残存肝癌的靶向诊断与治疗中发挥重要作用