镉诱导ZIP8磷酸化调控其蛋白稳定性的生物学功能及其分子机制研究

The metal ion transporter ZIP8, which is able to transport zinc ion from the extracellular and intracellular organelles into the cytoplasm, plays an important role in maintaining the dynamic balance of zinc homeostasis. ZIP8 also has the ability to import cadmium ion, which is a pervasive and highly toxic heavy metal carcinogen. In our previous studies, we found that cellular, ZIP8 protein stability can be sustained by lysosomal inhibitor (NH4Cl) and/or proteasomal inhibitor (MG132) treatment. In addition, we found that the level of ZIP8 protein was positively correlated with the phosphorylation of p38 MAPK and JNK in cells treated with cadmium. Through bioinformatic and tandem mass spectrometry analyses, four novel phosphorylation sites were identified in ZIP8 upon cadmium treatment. Based on the above, the aim of this project will further focus on delineating the critical phosphorylation site(s) of ZIP8 which correlated with p38 MAPK and JNK activity, and the relationship to the regulation of ZIP8 protein stability and turnover. The results from this study will certainly reveal novel biological insights on the ZIP8 regulatory network and at the same time providing potential measures to antagonize the toxic and carcinogenic effects of cadmium.

金属离子转运蛋白ZIP8，能将胞外和细胞器内的锌离子转运进入细胞浆，在维持锌离子动态平衡方面发挥重要作用，对细胞正常功能的行使至关重要。ZIP8还具有转运镉离子的能力，而镉是一种剧毒且易于积聚不易排泄的重金属致癌物。前期研究中，我们发现在正常培养细胞中，ZIP8蛋白就有一部分会降解，这一降解过程可以被NH4Cl和MG132抑制。另外，还发现ZIP8蛋白水平在镉处理细胞中与p38 MAPK、JNK的磷酸化水平呈潜在的正相关。通过生物信息学分析和pull-down加磷酸蛋白质谱分析，结果显示ZIP8中有4个位点在镉刺激时发生了磷酸化，本项目拟在此基础上，进一步研究阐明每一个磷酸化位点与蛋白激酶p38 MAPK和JNK活性，以及与ZIP8降解的调控关系，在揭示ZIP8调控网络的同时，探讨这一调控机制对镉急性毒性反应、镉诱导细胞转化以及镉诱发肿瘤的药物敏感性等方面的的生物学意义。

本课题组的研究结果及国际同行的报道都表明ZIP8蛋白具有镉离子转运功能，本项目在ZIP8敲除细胞构建的基础上，研究发现ZIP8蛋白表达水平能够影响氯化镉的细胞毒性反应，而氯化镉同时具有诱导ZIP8蛋白水平升高的作用，这可能更加剧了镉离子被转运进入细胞，发挥细胞毒作用。通过对细胞中ZIP8转录翻译和蛋白质稳定性的分析，确定了氯化镉处理后蛋白稳定性增加是氯化镉诱导ZIP8蛋白水平升高的主要原因。质谱分析的结果表明，氯化镉处理后ZIP8蛋白分子上出现了多个磷酸化位点，通过构建突变体研究发现，S275、S278、S288、T424位点的磷酸化与ZIP8蛋白稳定性具有相关性，且这些位点能够被镉处理后活化的蛋白激酶——p38 MAPK和JNK1/2磷酸化，磷酸化后的ZIP8的泛素化和降解水平均显著下降。研究中发现，硒的存在能够抵消部分镉诱导ZIP8水平升高导致的细胞毒性，ICP-MS检测的结果表明，硒亦可以通过ZIP8进行转运，且硒的转运能够抑制镉向细胞内的运输，进一步鉴定发现，G38和S335这两个SNP位点是影响ZIP8硒转运功能的重要位点。本研究一方面揭示了镉暴露通过个别位点的磷酸化，抑制ZIP8的降解，从而加剧镉离子被转运进入细胞，发挥细胞毒作用的分子机制，另一方面在发现硒具有抑制镉转运作用的基础上，探索了硒抵抗镉细胞毒性的可行性，为进一步研制镉暴露的防治药物提供了思路。