EZH2通过Notch3受体激活Notch通路以维持骨肉瘤干细胞自我更新的作用及分子机制研究

Osteosarcoma is a common malignant bone sarcoma which mainly occurs in teenagers. Osteosarcoma stem cell (OSC) is considered to be the main target of treating osteosarcoma. Previously, we found that EZH2 expressed in majority of clinical samples. EZH2 overexpression leads to Stemness related genes over-expression, but the mechanism is not clear. Further experiments revealed that EZH2 overexpression could up-regulate Notch3 expression and activate it, and Notch pathway is activating in OSC. Based on these, we suggest that EZH2 could increase Notch3 expression and activate Notch pathway, eventually regulate OSC. EZH2 is reported lately to directly bind promoter region of Notch receptor and activate its transcription. To conform this hypothesis, EZH2 and Notch3 will be over-expressed and repressed in OS cells. The surface markers of OSCs and differentiation cells, expressions of Nanog, Sox2 and Oct4, spere formation, tumor generation will be tested. Next, Using reporter gene assay and ChIP assay, we could understand the exact mechanism of how EZH2 up-regulating Notch3 expression.

骨肉瘤是常见于青少年的骨原发的恶性肿瘤，骨肉瘤干细胞（OSC）被认为是骨肉瘤靶向治疗的关键靶点。前期研究中我们发现EZH2在骨肉瘤中普遍表达，高表达EZH2可以影响OSC的自我更新及干性基因表达，但其中的分子机制尚未明确。进一步研究提示，EZH2高表达后可以上调及激活Notch3表达和活性，从而激活Notch通路，而Notch通路在OSC中明显激活，因此我们提出EZH2通过上调Notch3表达激活Notch通路，进而参与OSC干性的调控。EZH2最近被发现可以直接结合Notch通路受体启动子并激活其转录，因此我们拟差异表达EZH2和Notch3分子，检测OSC表面标记表达、干性基因表达水平、体外成球和体内成瘤能力、多向分化能力明确EZH2增强OSC的自我更新能力是通过激活Notch3通路实现的；结合报告基因技术及ChIP技术，阐明EZH2上调Notch3表达的分子机制。

骨肉瘤是常见于青少年的骨原发的恶性肿瘤，骨肉瘤干细胞（OSC）被认为是骨肉瘤靶向治疗的关键靶点。EZH2在骨肉瘤中普遍表达，EZH2在骨肉瘤中的过表达可以增强骨肉瘤细胞增殖、远处转移和化疗抵抗能力，高表达EZH2可以影响OSC的自我更新及干性基因表达，但其中的分子机制尚未明确。NOTCH3通路在多种肿瘤发生发展中起到重要作用，EZH2可以上调NOTCH3表达和增强其活性，因此我们认为EZH2激活Notch3通路参与OSC干性的调控。我们利用干细胞培养基悬浮培养得到骨肉瘤干细胞模型，发现骨肉瘤干细胞中EZH2表达增加，NOTCH3受体的激活。骨肉瘤干细胞球中NOTCH通路配体DLL1、DLL4、Jag1和Jag2的表达明显升高，NOTCH3受体表达升高，关键效应分子表达上调，NOTCH3受体活性增加。差异表达NOTCH3和EZH2的骨肉瘤细胞模型，在骨肉瘤中过表达EZH2后，Nanog、Sox2和NOTCH通路效应分子Hes1、Hey1表达都有明显上调，NOTCH3及DLL4表达有明显上调，NOTCH3激活段增加。差异表达EHZ2和NOTCH3后骨肉瘤干细胞比例、自我更新能力及体内成瘤能力都受到显著影响。在临床样本中我们发现，EZH2、NOTCH3、HES1以及干性因子都不同程度表达，Nanog、EZH2和NOTCH3有重要的预后意义，其中EZH2和NOTCH3共同表达水平是预后的独立危险因素。Hes1在骨肉瘤患者中也有重要的临床病理意义。在骨肉瘤细胞中抑制NOTCH配体的表达，不能逆转EZH2上调NOTCH3受体表达及增强NOTCH3活性的作用，也不能逆转EZH2增强骨肉瘤干性因子及自我更新能力的作用，提示EZH2对NOTCH3的调控不依赖传统激活途径。本研究探讨了OSC调控的分子机制，提出EZH2、Notch3通路在OSC自我更新调控的重要作用及临床意义，阐明了EZH2通过上调和激活NOTCH3通路从而发挥作用。本研究结果对理解骨肉瘤及OSC的分子调控机制提供了新的观点，为骨肉瘤临床诊断和预后判断提供了有用的标志物，为开发骨肉瘤治疗的新靶点提供了实验依据。