影响H9N2禽流感病毒气溶胶传播效率的分子机制

前期筛选到两株遗传背景相似、气溶胶传播效率差异显著的H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV），并已进行全基因组测序，但对哺乳动物气溶胶传播效率的机制还不清楚。为进一步探索H9N2亚型AIV在哺乳动物气溶胶传播效率差异的分子机制，本项目拟采用反向遗传技术构建两个毒株的8基因转录/表达质粒，两个毒株之间单个基因或基因组合如HA+NA进行相互替换，拯救重组病毒，通过细胞感染试验和豚鼠动物模型来进行生物学特性分析，根据其对细胞的致病性、豚鼠体内分布情况、组织滴度和病毒载量等水平的不同，确定影响H9N2 AIV在豚鼠气溶胶传播效率的主要基因。根据基因组生物信息学分析结果对该基因上差异功能位点进行定点突变，比较突变株生物学特性，最终确定影响H9N2 AIV 在豚鼠气溶胶传播效率的某个氨基酸或核苷酸位点。

低致病性H9N2禽流感病毒在集约化养殖场中发病率高、传播速度快、对养禽业造成巨大经济损失。其中气溶胶传播是流感病毒感染宿主的一个重要间接接触途径，与直接接触导致的感染相比，它在一个群体中的波及面更广、传播速度更快。因此，了解气溶胶传播的相关分子机制对于防控H9N2禽流感疫情具有重要意义。.本项目任务目标是：研究影响H9N2禽流感病毒气溶胶传播的分子机制，确定决定H9N2禽流感病毒气溶胶传播的关键基因和关键位点，该任务已经完成。在此基础上还初步探索了PA-X蛋白（流感病毒PA基因移码产生的一种蛋白）对于H9N2病毒传播能力和致病性的影响。结果如下：.1、气溶胶遗传背景相近而传播能力不同的H9N2亚型禽流感病毒的筛选.从1998-2011年获得的禽流感病毒分离株中筛选出遗传背景相近但气溶胶传播能力差异的H9N2病毒：具有气溶胶传播特性的A/chicken/Shanghai/7/2000 (SH7)株和不具有气溶胶传播特性的A/chicken/Shanghai/14/2000 (SH14)株。.2、确定H9N2亚型禽流感病毒气溶胶传播相关的病毒基因和关键氨基酸位点及其作用机制.以SH7和SH14为研究对象，通过反向遗传技术，将单个基因或两个以上基因组合在两个毒株之间进行互相替换，结果说明PA和HA基因是影响H9N2禽流感病毒气溶胶传播的关键基因，NP和NS基因对传播有辅助作用；通过点突变发现HA的363位氨基酸和PA的672位氨基酸是影响病毒气溶胶传播能力的关键位点，这些关键位点对排毒水平、病毒聚合酶活性、酸稳定性、热稳定性产生影响，综合分析了H9N2亚型禽流感病毒的气溶胶传播能力的分子机制。.3、PA-X蛋白对H9N2禽流感病毒传播能力的影响.初步探索了PA-X蛋白对于H9N2病毒传播能力和致病性的影响，SH7相较于7PAXD病毒(SH7的PA-X蛋白缺失株)而言能够诱导更为强烈的炎症反应，炎性细胞因子均不同程度上调表达，这虽然与已经发表的H1N1流感病毒中PA-X蛋白能够降低病毒致病性的结果有所差异，但是H9N2禽流感病毒对哺乳动物和禽类都是低致病性病毒，因此推测PA-X蛋白作为流感病毒的非必须蛋白是协助病毒更好适应环境的辅助蛋白。该数据首次提供了H9N2禽流感病毒PA-X蛋白的生物学作用数据，推进了人们对于PA-X蛋白在流感病毒中功能的认识。