SARS样冠状病毒特有基因orfX的功能研究

Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) is the causative agent of the 2002-03 SARS pandemic. In our previous studies, we have discovered genetically diverse SARS-like coronaviruses (SL-CoVs) from Chinese horseshoe bats and isolated one SL-CoV (WIV1) that has a higher similarity with the SARS-CoV in genomic sequences, and uses the same receptor, ACE2, as the SARS-CoV. Our results further demonstrated that Chinese horseshoe bats are natural reservoirs of the SARS-CoV. Cell susceptibility experiment indicated demonstrated that WIV1 can infect cell lines derived from human, pig, monkey, and bat, indicating WIV1 has a broad host range. However, compared with the SARS-CoV, the WIV1 has an additional unique open reading frame X (orfX). Preliminary experiments showed that orfX is a functional protein and can inhibit type I interferon in human cells. In this project, we will further investigate it’s function through cellular localization, regulation of type I interferon response and effect on virus replication. The expected results will be helpful for understanding of the pathogenesis of WIV1.

SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起严重急性呼吸综合症，而蝙蝠携带遗传多样的SARS样冠状病毒（SL-CoVs），被认为是SARS-CoV的自然宿主。近期我们在菊头蝠发现了一类更接近SARS-CoV的病毒，并首次成功分离到一株与SARS病毒高度同源的SL-CoV（WIV1）。证实WIV1同SARS-CoV一样，利用受体ACE2入侵细胞，能感染人、猪、猴、蝙蝠等多种哺乳动物细胞，显示其宿主范围广泛。WIV1和SARS-CoV基因组结构最大的不同在于其特有的orfX基因，编码一个约9kD的蛋白，初步实验显示ORFX是一个有功能的蛋白，在人细胞系中可以抑制I型干扰素生成，推测其功能与病毒致病性相关。本研究将进一步分析ORFX蛋白在感染细胞中的定位、对病毒复制的影响以及调节人类干扰素应答的机制，揭示ORFX蛋白对病毒增殖和致病能力的影响，为后续更深入研究SL-CoV致病机理提供基础。

SARS冠状病毒（SARS-CoV）由SARS样冠状病毒（SL-CoV）演化而来，前期从蝙蝠分离到与SARS-CoV高度同源的SL-CoV（WIV1），发现WIV1有独特的orfX基因。本研究通过Northern-blot检测到orfX的亚基因组RNA（sgRNA-X）、用免疫荧光检测到WIV1感染细胞后ORFX蛋白的表达，证明orfX是一个功能基因；通过反向遗传学技术构建了orfX基因缺失毒株（rWIV1-ΔX），通过比较rWIV1-ΔX和WIV1的细胞感染和增殖水平，证实了orfX缺失不影响WIV1的体外感染和复制；细胞免疫荧光实验证实ORFX蛋白定位在细胞质，并且和内质网有共定位；通过IFN-β和NF-κB萤光素酶报告系统、免疫荧光、定量PCR实验，证明了ORFX蛋白通过抑制IRF3的入核从而抑制I型干扰素生成，且抑制效率随ORFX表达量的增加而降低，另外发现ORFX可以激活NF-κB并上调下游的细胞因子，如IL-8等。本研究证明SL-CoV WIV1特有基因orfX是一个功能基因，并且参与了宿主免疫调节，但是不影响病毒的体外复制，研究结果拓展和加深了我们对SL-CoV在自然界的流传、进化、传播的理解，为后续SL-CoV的致病性、动物感染等研究提供了基础。