丽江云杉PlMKK6基因的可变剪接在胞质分裂中的功能研究

Cytokinesis in plant cells is mediated by a mitogen-activated protein kinase cascade (ANP-MKK6-MPK4). In our previous studies, we found that MKK6 gene is evolutionarily conserved in plants and exists as single-copy in higher plants. However, two homologs of MKK6 gene can be found in gymnospermous Picea glauca and we also cloned two mRNA (PlMKK6-1 and PlMKK6-2) in gymnospermous Picea likianensis. Our preliminary results showed that PlMKK6 gene in P. likianensis is regulated by alternative splicing. This research project use P. likianensis as material to confirm the alternative splicing of PlMKK6 gene, and to explore the function of splicing variants (PlMKK6-1 and PlMKK6-2) in plant cytokinesis, combining the experiments in tobacco BY-2 cells and arabidopsis thaliana. This research project will reveal the function of alternative splicing in gymnospermous cytokinesis and provide meaningful information to us about the difference of mitogen-activated protein kinase cascade in higher-plant cytokinesis and gymnospermous cytokinesis.

植物细胞的胞质分裂受促分裂原活化蛋白激酶级联途径（ANP-MKK6-MPK4）的调控。我们前期的研究发现植物的MKK6 基因在进化上是高度保守的，在高等植物中呈单拷贝存在。但是，在裸子植物白云杉（Picea glauca）中，我们发现了2 条MKK6 基因的相似序列，并在丽江云杉（Picea likianensis）中扩增到2 条mRNA（PlMKK6-1 和PlMKK6-2）。我们的初步研究表明，丽江云杉PlMKK6 基因受可变剪接机制的调控。本项目将以丽江云杉为研究对象，证实PlMKK6 基因可以发生可变剪接，并结合烟草BY-2 细胞系和拟南芥的相关实验，探讨PlMKK6 基因的可变剪接体（PlMKK6-1 和PlMKK6-2）在胞质分裂中的功能。本项目将揭示裸子植物基因的可变剪接机制在胞质分裂中的功能，对认识促分裂原活化蛋白激酶级联途径调控高等植物和裸子植物胞质分裂的异同有重要意义。

胞质分裂是细胞分裂的最后关键一步。拟南芥的研究表明，胞质分裂受促分裂原活化蛋白激酶信号的调控。本项目以裸子植物丽江云杉幼苗为研究对象，证实了促分裂原活化蛋白激酶的激酶6（PlMKK6）基因至少存在着2个不同序列的转录本PlMKK6-1和PlMKK6-2，两个转录本是基因可变剪接的结果。但是，PlMKK6-2编码一个缺少关键功能区的短肽。我们的研究结果表明，PlMKK6-1基因主要在丽江云杉幼苗细胞分裂旺盛的组织表达，如根尖、茎尖和新生幼叶。PlMKK6-1蛋白的抑制剂PD98059处理丽江云杉幼苗根尖，组织切片可以观察到含有两个细胞核的畸形细胞，说明PlMKK6-1蛋白可能对细胞胞质分裂是必须的。洋葱表皮瞬时转化分析表明，PlMKK6-1-GFP蛋白主要定位于细胞质。BY-2细胞系的转化和分析表明，PlMKK6-1-GFP蛋白在胞质分裂末期表达。表达组成失活的PlMKK6-1蛋白（PlMKK6-1-KR），BY-2细胞系的胞质分裂受阻，可以观察到双核的畸形细胞，表明PlMKK6-1蛋白在胞质分裂过程中是有功能的。