顽拗性药用植物种子超低温保存特性研究

The best method for long-term storage of recalcitrant plant germplasm is liquid nitrogen cryopreservation. But there are less liquid nitrogen cryopreservation research on recalcitrant plant, especially on med-recalcitrant plant germplasm. With the establishing of National Essential Drugs Germplasm Bank of recalcitrant plant, solve the problem of recalcitrant seeds`s liquid nitrogen cryopreservation become urgent. In previous research, we concluded that recalcitrant seed `s cryopreservation depending on Genera . And it may relate to the structure and component of herb seed. In order to find regular pattern of herb seed cryopreservation, we want to research the seed construction, cell morphology and inclusions by microscopic identification about 75 species herb seed in 50 Genus. And we also test the difference of germination rate, dehydrogenase activity, MDA and Antioxidant system.This work will lays theoretical and practical foundation about long-term stability preservation of herb recalcitrant seeds, promote the protection of medicinal germplasm resources.

液氮超低温保存法是长期贮藏顽拗性植物种质的最佳方法，但国内外对顽拗性植物种质超低温保存特性的研究甚少，特别是顽拗性药用植物种质几乎空白。随着我国第一个保存顽拗性药用植物种质的专业国家种质库——国家基本药物所需中药材种质资源库的建立，解决顽拗性药用植物种子超低温保存特性问题的研究愈加迫切。课题组前期研究发现，顽拗性种子超低温保存特性因科属种而异，我们认为这可能是跟药材种子的结构、成分等有关系。本项目拟对20科50属75种顽拗性药用植物种子进行超低温保存特性研究，基于显微鉴定技术观察超低温处理前后种子内部组织构造、细胞形态和内含物特征的变化；基于生化分析技术检测超低温处理前后种子发芽、脱氢酶活性、丙二醛含量以及抗氧化系统的差异，进而找出不同种药材种子超低温保存的共性规律。该研究将为解决顽拗性药用植物种子批量长期稳定保存奠定理论实践基础，对推动我国药用植物种质资源安全保护起到积极作用。

项目通过对52科97属113种药用植物种子进行贮藏特性确定实验，明确了其中44科69属81种为顽拗性性种子，并对113种药用植物种子进行超低温冷冻，摸索得到了113种种子超低温保存的最适条件。针对81种顽拗性种子建立了81套顽拗性药用植物种质超低温保存方法，并通过中华中医药学会发布《药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则》和《白木香等48种药用植物顽拗性种子超低温保存技术规程》。通过采用生理生化分析技术检测超低温处理前后75种种子α-淀粉酶活性、脱氢酶活性、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、蛋白质含量以及电导率的差异，发现超低温冷冻对62.67%的种子萌发能力没有特别大的影响；减弱了53.62%的种子呼吸作用，削弱部分种子的活性；加强了52%种子的抗氧化活力；可能破坏了52.38%的种子的细胞膜完整性和30.67%的种子的酶系统；增强了50.67%的种子清除自由基的能力，降低了超低温对种子活力的损伤。通过采用显微鉴别技术观察超低温处理前后75种种子内部组织构造、细胞形态和内含物特征的变化，发现29.33%的种子经液氮冷冻后其横切表面与对照相比无差异，而70.67%的种子横切表面较对照暗淡、部分出现褐化或失水干裂，但液氮冷冻对大部分种子外观形态无明显影响。液氮冷冻对75种药用植物种子种子结构未造成不可逆的损伤，对超低温保存效果的影响不显著。本项目的研究表明，液氮超低温冷冻对羯布罗香等75种药用植物种子的结构和生理生化特性无伤害性影响，这对国家南药基因资源库的种质入库起到了技术支撑作用。项目组采用液氮超低温冷冻技术，首次建立了羯布罗香等81种顽拗性药用植物种子超低温保存技术，弥补了国内顽拗性药用植物种子长期保存的空白，为解决顽拗性药用植物种子超低温长期稳定有效保存问题提供了实验依据，为药用植物资源库和中药质量标准库的建设提供了良好的实践基础，对推动我国药用植物种质资源安全保护起到积极作用。