Let-7d影响肾癌浸润巨噬细胞表型分化从而抑制肿瘤血管生成的机制研究

Renal cell carcinoma (RCC) is one of the common urological cancers. Angiogenesis play an important role in the malignant progression of RCC. Infiltrating M2 type tumor-associated macrophages in the cancer tissue have important roles in promoting angiogenesis. Plenty of M2 macrophages infiltrated in the anti-angiogenesis drug sorafenib resistant RCC tissues. MicroRNA let-7 d has been found as a tumor suppressor in many types of cancer. Our previous studies have shown that the let-7d was significantly down-regulated in RCC, and overexpression of let-7d can inhibit the tumor angiogenesis. To investigate whether this is attributed to macrophages, firstly, we try to collect the conditional medium from macrophages that co-cultured with let-7d overexpressing renal cancer cells and assess its effects on proliferation, migration and tubule-like structure formation of human umbilical vein epithelium cells. The phenotypic differentiation and the secretion of angiogenic factors are assessed in co-cultured macrophages. Then, the macrophages infiltrated in let-7d overexpressing mice model of RCC were collected, the M2 macrophages were sorted by flow cytometry, and their effects on angiogenesis were assessed. Using in silico analysis and experimental validation, we try to find the target genes of let-7d. To further assess whether the predicted target genes were functional, angiogenesis and macrophage differentiation will be evaluated in in co-culture system and mice model of tumor xenograft by rescued expression of the target genes. . Finally, the correlation between let-7d expression and the target genes levels in clinical RCC specimens will be assessed. Our study will prompt whether let-7d could be used as a novel target for reversing anti-angiogenesis drug resistance of RCC.

肾癌是常见的泌尿系肿瘤之一，血管生成在其恶性进展中起重要作用，肾癌中浸润的M2型巨噬细胞具有促血管生成作用。抗血管生成药物索拉非尼耐药的肾癌组织中有大量M2型巨噬细胞浸润。MicroRNA let-7d已被发现在多种肿瘤中起抑制作用。我们前期研究发现，let-7d在肾癌中表达显著下调，过表达let-7d可抑制肾癌血管生成。为探明其是否与巨噬细胞有关，我们首先将let-7d过表达肾癌细胞与巨噬细胞共培养，观察其条件培养基对血管内皮细胞的影响，并研究共培养后巨噬细胞的表型分化和血管生成因子的分泌。然后通过流式分选富集并观察let-7d过表达小鼠移植瘤中M2型巨噬细胞的比例及其对血管生成的影响。使用生物信息学方法寻找let-7d相关靶基因，并在细胞共培养体系及小鼠成瘤模型中过表达该靶基因，观察其对巨噬细胞表型分化及血管生成影响。本研究提示let-7d或许可作为逆转肾癌抗血管生成药物抵抗的新靶点。

微小RNA （microRNA） let-7d 已经被发现在多种肿瘤中可以起到肿瘤抑制因子的作用， 我们前期的研究也发现，Let-7d在肾癌中低表达，在肾癌细胞中过表达let-7d可以抑制肾癌细胞的增殖、迁移及其多单核细胞的趋化作用。肿瘤相关性巨噬细胞 (TAM) 是一种向M2类型分化的巨噬细胞，已经被发现在多种肿瘤中可以促进肿瘤生长和肿瘤血管生成。然而let-7d在TAM相关的肾癌进展中的作用尚未有研究。首先我们在临床标本水平观察到 let-7d 的表达和肾癌组织内微血管密度成正比。而且将巨噬细胞系THP-1与let-7d过表达的肾癌细胞系共培养后，其条件培养基进一步培养血管内皮细胞系HUVEC，可以使其增殖、迁移及血管形成能力较与对照肾癌细胞共培养后的THP-1产生的条件培养基显著下降。并且与let-7d过表达的肾癌细胞系共培养后的THP-1细胞中M2类型巨噬细胞的比例也较与对照组肾癌细胞共培养的THP-1 低。在动物实验中，将过表达let-7d的肾癌细胞786O与THP-1细胞混合后种植于小鼠皮下成瘤，发现肿瘤内M2类型巨噬细胞的比例及微血管密度显著低于对照组786O细胞与THP-1细胞混合成瘤的小鼠。通过生物信息学预测及后续的荧光素酶报告基因检测，我们发现白介素10 (IL-10) 和白介素13（IL-13） 是let-7d的靶基因，并且在THP-1和let-7d过表达肾癌细胞共培养的培养体系中分别加入 IL-10 and IL-13可以增加共培养的THP-1细胞中M2类型巨噬细胞的比例，并且逆转共培养的THP-1细胞条件培养对HUVEC细胞的作用。这些作用可能和加入IL-10 and IL-13可以使得共培养的THP-1细胞胎盘生长因子（PIGF）分泌增加有关。动物实验水平，通过分别在稳定过表达let-7d的肾癌细胞系中过表达 IL-10 和 IL-13 ，然后分别与THP-1细胞混合后小鼠皮下成瘤，发现两者都可以逆转肾癌细胞let-7d过表达所引起的M2类型巨噬细胞比例下降及微血管密度下降的现象。最终我们在80例肾癌的临床标本中，通过PCR研究发现，IL-10 和 IL-13 的表达与微小RNA let-7d 的表达呈逆相关。因此我们的研究提示，let-7d可以抑制肾癌中巨噬细胞向M2类型分化，并且抑制肾癌的血管生成。