DNA甲基化在植物转录调控中的作用机制

As an important chromatin modification, 5’ methylcytidine (meC) has long been known as silencing mark for transposon in the genome. meC in promoter region prevents gene from transcription initiation. However, it is unclear whether meCG, meCHG, and meCHH play a consistent regulatory role through the transcription cycle. Here, we propose to dissect the function of meC in transcription initiation, elongation, and termination via genetic, biochemical and epigenomic approaches. We have established two methods, GRO-seq and mNET-seq, to monitor nascent RNA synthesis. Preliminary analysis reveals different effects of meC loss at different transcription steps. To rule out the possible indirect effects from transcriptional cascade, post-transcriptional processing and mRNA degradation, a difference between wildtype and meC deficient plants will be investigated at nascent RNA level. Regulatory mechanism will be revealed combining correlation between differential meC and altered nascent RNA synthesis, distribution of initiation, elongation, and termination protein factors, and meC preference of RNA polymerase II associated DNA. These data will further shed light on the epigenetic regulation of transcription in plants and how these mechanisms evolved in high eukaryotes.

胞嘧啶5位甲基化（meC）是最早发现的重要表观遗传标记，在基因组中沉默转座子，在基因启动子中抑制基因转录。然而在转录周期中，对三种meC（meCG、meCHG和meCHH）各自的作用，缺少系统研究。我们前期已成功建立了GRO-seq和mNET-seq两种新生链RNA检测方法，初步发现在转录周期的不同步骤，meC缺失产生的效应不同。本申请结合遗传学、生物化学和表观组学等手段，以拟南芥为模式探索meC在转录起始、延伸和终止中的作用。对野生型与meC缺陷突变体中新生链RNA合成的直接比较将排除转录后加工和mRNA降解等间接效应。通过关联meC差异与新生链合成的差异，比较转录起始、延伸和终止的辅助蛋白分布，检测RNA聚合酶结合DNA的meC偏好，有望阐明高等植物meC调控转录的具体机制，揭示高等真核生物转录的表观遗传调控规律，为理解meC等表观遗传标记调控作用的进化历程提供线索。

DNA中胞嘧啶5位甲基化 (meC) 是最早发现且重要的表观遗传标记，已知DNA甲基化具有沉默转座子，在基因启动子中抑制基因转录的作用。但目前关于DNA甲基化在转录周期中的作用尚缺少系统研究。本项目结合遗传学、生物化学和表观组学等手段，以拟南芥为模式探索meC在转录起始、延伸和终止中的作用。本项目进行的主要研究内容与结论如下：(1) 对野生型与3种meC缺陷突变体 (suvh456, ddc, met1) 的全基因组甲基化比较分析，发现met1缺失后CG甲基化显著降低，而ddc和suvh456突变体中nonCG (CHH和CHG) 甲基化显著降低；(2) 比较甲基化缺失突变体和野生型新生RNA合成的差异，发现在近终止区和终止区ddc与met1突变体信号高于野生型，而suvh456突变引起信号降低；(3) 分析甲基化变化区域中新生RNA的转录变化趋势，发现CG甲基化降低影响转录终止区新生RNA的分布，而nonCG甲基化缺失使基因的转录活性提高；(4) 通过BisChIP-seq揭示拟南芥苗期RNA聚合酶II结合的DNA甲基化程度，发现总体而言Pol II倾向于结合甲基化程度较低的DNA；(5) DNA甲基化能够抑制部分位点的多聚腺苷酸化，在甲基化缺失突突变体中多聚腺苷酸化位点使用的上调与DNA甲基化降低程度显著相关; (6) 优化了几种新生RNA方法，并系统比较不同方法的优缺点。通过以上研究为揭示高等真核生物转录的表观遗传调控规律，为理解meC等表观遗传标记调控作用的进化历程提供线索。