肌萎缩侧索硬化症FUS突变的神经元损伤机制及修复研究

Amyotrophic Lateral Sclerosis （ALS）is a fatal neurological degenerative disease with highly genetic and clinical heterogeneity, characterized by selective degeneration of motor neurons. To date, more than 30 disease-causing genes have been identified for ALS; among them FUS gene is the most common gene correlating with juvenile-onset ALS. Patients carrying FUS mutations often show an earlier age of onset and progress aggressively. The underlying mechanism of FUS mutation for severe form of ALS and the vulnerability of motor neuron are still uncertain. Autophagy was identified to be involved in the molecular mechanism of ALS, but it was controversial. Previously, we have generated the fibroblasts from FUS mutation ALS patients and further reprogrammed them into iPS cells. Under nutrition-deprived circumstance, FUS-mutant fibroblasts showed high expression of mTOR, high activity of LDH and abnormal of autophagy-lysosome, which hinted the probable impairment of autophagy in FUS mutant ALS. In the present work, we will induce the FUS -iPS cells into motor neurons in vitro and explore the mechanism of motor neuron vulnerability from the aspect of autophagy. Finally, we also intend to correct the FUS mutation by the advanced CRISPR/Cas9 technology and observe the phenotype rescue in motor neurons, which also shed light on the treatment of ALS in future.

肌萎缩侧索硬化症(ALS)是一种特异性累及运动神经元的变性疾病，具有高度的表型及遗传异质性。肉瘤融合基因（FUS）是青年型ALS最常见的致病基因，多数FUS突变患者起病年龄早、病程进展快。既往研究提示FUS突变蛋白在胞浆中异常聚集，抑制自噬早期触发及自噬-溶酶体形成，导致运动神经元损伤。我们前期在FUS突变成纤维细胞中也观察到mTOR蛋白表达升高、LDH释放增加、自噬-溶酶体异常，进一步支持自噬功能受损可能参与运动神经元的损伤。但自噬系统通路庞杂，FUS突变蛋白的作用环节仍不明确，能否通过上调自噬及基因修复实现运动神经元表型改善，均是亟待解决的问题。本项目拟将FUS突变iPS细胞分化为运动神经元，观察mTOR、Bcl-2、Rab1等通路蛋白表达情况，进一步采用雷帕霉素干预，同时采用CRISPR/Cas9技术修复FUS突变，观察自噬通路及表型的变化，明确FUS突变运动神经元损伤的自噬机制。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种成人起病的致死性运动神经元变性疾病，发病机制复杂、缺乏敏感的生物标志物和有效的药物治疗。而且，患者来源、疾病相关的运动神经元标本获取困难。肉瘤融合基因（FUS）是中国ALS患者最为常见的致病基因之一，FUS突变患者具有发病年龄轻、临床表型重、疾病进展快的特点。本项目以ALS患者为研究对象，开展FUS、SOD1、TDP-43等常见致病基因突变筛查，明确患者基因突变谱，同时结合临床特征，开展基因型-临床表型分析，指导临床诊断、治疗、预后判断及遗传咨询。进一步结合诱导多能干细胞（iPS）和运动神经元定向分化技术，体外获得了携带FUS P525L突变患者的iPS细胞，分化获得运动神经元，在运动神经元水平观察到神经元胞浆中FUS蛋白表达增加，神经元突起断裂、坏死，自噬通路和无义介导的mRNA降解途径异常。我们还发现神经丝蛋白-轻链（NfL）能够敏感地反映FUS突变运动神经元突起的损伤，在患者血浆中也证实了NfL浓度跟ALS的发病、疾病严重程度显著相关。我们还尝试了血浆光谱分析技术，目前研究发现血浆光谱特征能够很好地区分ALS患者和健康对照，区分不同疾病进展速度的ALS患者，但仍需要进一步验证ALS特异的光谱谱带。我们还获得了FUS突变修复的野生型iPS细胞系，引进并培育了FUS R521C点突变knock in大鼠模型，为后续进一步的发病机制研究和药物治疗探索提供了有利的细胞和动物模型。