NLS自然突变介导的N蛋白入核机制的影响及其在HP-PRRSV复制中的作用研究

The karyoplasm shuttle of NLS mediate is significant for viral infection and replication, comparing with the classical PRSSV, the key site of NLS region where HP-PRRSV N protein exist the consistent natural mutation. In this proposal, N protein mutant and revertant were constructed by Site-directed mutagenesis respectively, after connecting the EGFP eukaryotic expression vector, identifying the impact of NLS region mutation for the intracellular location and expression of N protein using laser confocal, Western-blot technique; Screening and identifying the N protein receptor before and after mutation using the Co-Immunoprecipitation and RNAi ; The kinetics behavior of nuclear protein and receptor will be evaluated by BLI technique.Using Reverse genetic technology to further identify the role of nuclear input mechanism in viral infection and replication. The aim of this study is to elucidate the effect of natural mutation in HP-PRRSV NLS region on the entry nucleus mechanism of N protein, and to clarify its role in the process of infection and replication of virus. The expected results will provide a new idea for the clarification of HP-PRRSV virulence enhancement mechanism, providing an important reference for the screening of new antiviral targets.

NLS介导的蛋白入核对于病毒的感染与复制具有重要意义，HP-PRRSV N蛋白NLS区存在一致性自然突变。本项目以CH-1a与JXA1为参照，分别构建N蛋白及其突变体真核表达载体，结合激光共聚焦与Western-blot技术验证NLS区突变对N蛋白细胞内定位及表达的影响；应用co-immunoprecipitation与RNAi技术对N蛋白核转运受体进行筛选与鉴定，采用BLI技术对入核蛋白与受体的动力学进行评估；借助反向遗传对HP-PRRSV感染性克隆进行NLS结构的回复性突变，病毒拯救后感染细胞，检测入核蛋白表达效率的同时测定病毒滴度，以此验证NLS自然突变介导的N蛋白入核机制的影响与病毒复制之间的相关性。本研究旨在阐明HP-PRRSV NLS区自然突变对N蛋白入核机制的影响，明确其在病毒复制过程中的作用，预期成果将为HP-PRRSV毒力增强机制的阐明提供新的思路。

NLS 介导的蛋白入核是细胞内信号传递网络中核质物质信息交流的重要一环， HP-PRRSV N蛋白NLS区存在一致性自然突变，然而其对该病毒入核机制的意义及病毒复制的影响均未见报道。课题组首先应用分子流行病学方法对PRRSV流行野毒株及多次传代后的流行代表毒株基因重组及突变情况进行分析，进一步证实之前发现的NLS区突变在近几年的流行的HP-PRRSV毒株中得以稳定遗传。联合应用定点突变、载体构建、免疫荧光、酵母双杂交及BLI等实验技术探究NLS区突变对N蛋白核质穿梭及其受体表达的影响，结果表明NLS区自然突变导致N蛋白核质穿梭能力增强，其机制初步解析为NLS区第46位氨基酸的自然突变导致N蛋白与入核转运受体KPNB1亲和力增加。通过反向遗传实验，项目进一步证实NLS区自然突变是HP-PRRSV病毒复制能力变强的原因之一；KPNB1沉默表达后，病毒的复制效率明显被抑制。本研究初步解析了HP-PRRSV NLS区自然突变对N蛋白入核机制的影响，初步明确了其在病毒复制过程中的作用，预期成果将为HP-PRRSV毒力增强机制的阐明提供新的依据，为抗PRRSV药物靶点的筛选提供新的思路。