RNA反式剪接的发生与调控机制研究

Trans-splicing integrates two distinct nascent transcripts into a single mRNA product. It is widespread in lower eukaryotes, such as trypanosomes and nematodes, by a reaction similar to that of cis-splicing, except a Y-structured intermediate is formed instead of a lariat intermediate. However, trans-splicing has been observed much less often in higher eukaryotes, and the mechanisms of these events have not been well investigated. To identify more trans-splicing events, we proposed to analyze transcriptome data from publicly available databases and our sequencing transcriptomes of various species and development stages by bioinformatics method that we recently designed. Further validating experiments will be performed, including allele-specific RT-PCR, DNA/mRNA FISH. In this proposal, our major task is to investigate the mechanism of trans-splicing. Firstly, we proposed several assays, such as mutagenesis of RNA elements in the two distinct genes, over-expression and knock down of splicing factors, most are SR proteins which are important for RNA splicing regulation. Secondly, we will investigate the functions of our new identified trans-splicing events at the level in both cell and organisms using various techniques. Our studies will elucidate the mechanism of trans-splicing occurrence, functions and their regulations, this will benefit to the field of development, gene expression and gene therapy.

反式剪接是一种将不同前体mRNA剪接成一条成熟mRNA的特殊剪接方式，它可以将来自不同转录本的遗传信息整合到一起。目前发现的反式剪接主要集中于锥虫、线虫等低等生物，但随着第二代测序技术的应用，高等生物中也发现了更多的反式剪接事件，它们对发育和疾病产生有着重要的作用。为了全面地鉴定出更多的反式剪接，详细研究它们的功能和调控机制，我们首先将通过生物信息学对于多种模式生物的转录组数据进行分析，寻找可能的反式剪接事件，然后通过荧光原位杂交等多种方法加以确认。同时，我们将结合转基因，RNA干扰和体内点突变等方法，研究反式剪接发生的机制。我们已经鉴定出一系列新的反式剪接事件，发现RNA二级结构在反式剪接中具有重要作用。另外发现SR蛋白作为一类重要的剪接调控因子，也可能参与了反式剪接的调控。本项目的研究将有利于阐明反式剪接的功能、机制和调控方式，对于研究基因表达调控、个体发育与疾病治疗都有重要的意义。

通过剪接体催化去除基因中的非编码序列（内含子），RNA剪接是真核生物基因表达与调控的关键步骤，它通常发生在一个前体RNA的分子内部，即“顺式剪接”(cis-splicing)，但是也可以发生在两个前体RNA分子之间，最终生成杂合的mRNA，称为“反式剪接”(trans-splicing)。作为一种非常规的剪接方式，反式剪接可以将两个不同转录本甚至两个基因的遗传信息整合到一起。尽管已知的反式剪接基因数量相对较少，但真核生物中普遍存在。在低等真核生物中，如锥虫与线虫，其绝大多数基因的前体RNA都需要进行反式剪接加工，它们是由Spliced leader (SL) RNA促进发生的。然而，高等真核生物体内并没有SL RNA存在，其反式剪接的发生机制一直都不甚清楚。本项目以家蚕和果蝇为材料，系统地开展了昆虫的反式剪接研究。. Mod(mdg4)和lola是昆虫中最经典的两个反式剪接基因，它们分别与昆虫的染色质重建和神经元功能密切相关。我们首先以mod(mdg4)为研究对象，通过细胞水平上的多种截短体和突变体研究，发现该基因反式剪接的发生取决于其5'共同转录产物的最后一个内含子中两个RNA片段，TSA与TSB。TSA与TSB的核心序列在基因组序列已知的12个果蝇属昆虫中高度保守。采用CRISPR/Cas9技术，在黑腹果蝇基因组中特异性地分别敲除这两个RNA片段，导致胚胎发育异常，孵化率明显下降。重要的是研究进一步证明TSA元件为mod(mdg4)基因反式剪接所必需，通过碱基配对，其核心的13 nt序列能够特异性地结合U1 snRNP，促使了反式剪接的发生, 并且TSA元件的单独存在就足以诱导反式剪接的发生。TSB元件具有十分保守的二级结构，起到反式剪接发生的增强子作用。除了发现mod(mdg4)的TSA元件在家蚕、棉铃虫和按蚊等昆虫中保守外，我们研究还显示TSA元件也存在于昆虫的lola基因在内的其它一些反式剪接基因中，从而揭示出高等真核生物中存在的一种新的反式剪接发生机制。本项目的部分研究内容于2015年发表在著名国际学术期刊《Genes & Development》。