GLTSCR1通过调控转录延伸抑制结直肠癌转移的机制研究

Transcription elongation misregulation is associated with various cancer pathogenesis as a key step in RNA transcription regulation. We found a novel microsatellite instability site in the coding region of GLTSCR1, which introduced a stop codon to translate a truncate protein of GLTSCR1. Furthermore, our previous data showed that GLTSCR1 was down-regulated in colorectal cancer samples and verified as an interacting molecule with BRD4 through CoIP and MS, which has been considered an important transcription elongation factor. However, the roles of GLTSCR1 and its interaction with BRD4 remain unknown. Therefore, we try to demonstrate the biological function of GLTSCR1 in colorectal cancer metastasis via knock-out/down and overexpression of GLTSCR1, and construct a series of truncated and mutated expression vectors to clarify the key interaction site between GLTSCR1 and BRD4. Moreover, the specific down-stream target genes and binding motif will be identified using RNA-seq and ChIP-seq. Finally, the methods for qualitatively measuring nascent RNA will be established to detect the changes of the transcription elongation which are regulated by GLTSCR1.Taken together, this study will elucidate a novel molecular mechanism that GLTSCR1 inhibits colorectal cancer metastasis through regulating transcription elongation.

转录延伸作为RNA转录关键限速步骤参与了各种肿瘤的发生发展。我们发现GLTSCR1基因在结直肠癌中存在一个新型微卫星位点突变能引起终止密码子提前出现导致其蛋白截断。前期研究发现GLTSCR1在结直肠癌组织中低表达，采用免疫共沉淀结合质谱技术确定了转录延伸调控因子BRD4与GLTSCR1结合。目前GLTSCR1的作用及其与BRD4在肿瘤中的相互作用机制仍不清楚。本课题拟通过敲除/敲降和过表达GLTSCR1确定其在结直肠癌转移中的作用；构建一系列截断或突变表达载体明确GLTSCR1与BRD4作用关键位点；采用RNA-seq和ChIP-seq确定GLTSCR1调控的下游靶基因及其结合DNA的特异性基序，并采用DRB介导的转录延伸暂停释放结合qRT-PCR技术实时定量监测GLTSCR1对下游靶基因转录延伸的调控过程。该研究将阐明GLTSCR1通过精细调控转录延伸抑制结直肠癌转移的全新分子机制。

基因转录调控在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用，而转录延伸是转录的关键环节，因此转录延伸调控可能参与了肿瘤的启动、生长、侵袭及转移等过程。然而转录延伸的精细调控在肿瘤转移中的作用机制仍不清楚。本课题通过比较TCGA数据库中微卫星稳定和不稳定的结直肠癌（CRC）样本基因突变的差异，发现位于19号染色体的GLTSCR1基因第六外显子上存在一个仍未被报道的微卫星位点，该位点由8个C串联重复序列组成（GLTSCR1-C8），且在24%的高频微卫星不稳定的结直肠癌样本中发生1个C的缺失（GLTSCR1-C7）或插入（GLTSCR1-C9）突变引起阅读框移码，导致GLTSCR1蛋白截短。我们在临床样本中不仅验证了该微卫星突变位点而且发现其在CRC中的表达明显低于正常组织样本，且低表达的GLTSCR1的CRC患者预后较差，通过体外和体内实验证实GLTSCR1的敲除或突变能够促进CRC转移。进而通过Co-IP实验阐明GLTSCR1通过它的羧基端的BB结构域与BRD4的BDs和PDID结构域结合。GLTSCR1突变产生的两种羧基端的截断蛋白，失去其与BRD4结合的能力，且GLTSCR1抑制CRC转移的功能依赖于与BRD4的相互作用。通过转录组测序分析发现GLTSCR1上调的差异表达基因(DEGs)富集于RNA Pol II启动子转录负调控的生物学进程中，其中GLTSCR1和BRD4共有88个重叠的DEGs，同时受二者共同调节。通过在线工具motif discovery online tool，我们预测了GLTSCR1在这88个重叠的DEGs启动子区域距离TSS位点-60到60处有一个TA富集的DNA结合motif，该区域恰好是Pol II暂停积累启动转录延伸的区域。并进一步证明GLTSCR1通过抑制Pol II在CTD区域Ser2位点的磷酸化，负向调控其靶基因SLC2A1、SLC2A3的转录延伸。同时通过调控ZO1的转录延伸速率影响ZO1 23号外显子的可变剪接抑制CRC转移。另外GLTSCR1敲除显著降低了对JQ-1和I-BET的敏感性，因此GLTSCR1可作为BET抑制剂治疗的敏感性的生物标志物。综上所述，本研究揭示了GLTSCR1在结直肠癌中的生物学功能以及其调控转录延伸的分子机制，GLTSCR1基因突变可能成为高频微卫星结直肠癌的标志，同时也为CRC靶向治疗提供了新的靶点。